熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？

對于熒光定量PCR反應(yīng)體系而言，cDNA模板的質(zhì)量至關(guān)重要。cDNA模板的濃度、純度、是否有一定程度的降解等等，都會(huì)影響熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。絕大多數(shù)情況下，cDNA的質(zhì)量和對應(yīng)的RNA質(zhì)量密切相關(guān)，高質(zhì)量的RNA保證了高質(zhì)量的cDNA。

基于有機(jī)試劑的一步萃取是一種非常有效的方法，能夠從多種細(xì)胞和組織中分離純化RNA。通常使用苯酚和異硫氰酸胍混合物(類似trizol)來破壞細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分，同時(shí)異硫氰酸胍是一種離液鹽，可保護(hù)核酸免受RNase的侵害以保證核酸的完整性。后加入氯仿并通過離心可將混合物分離成水相和有機(jī)相。在異硫氰酸胍存在下，RNA僅保留在水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則轉(zhuǎn)移到有機(jī)相和中間相中，最后通過異丙醇沉淀從水相中回收RNA。

該過程相對來說較快，可以產(chǎn)生較多的RNA，但是其中需要使用有毒的化學(xué)物質(zhì)，與其他RNA提取方法相比，可能導(dǎo)致更高的DNA殘留。殘留剩下的胍、苯酚或醇也會(huì)顯著降低cDNA的合成效率。

使用硅膠膜或磁珠的方法時(shí)，生物樣本會(huì)在異硫氰酸胍存在下進(jìn)行裂解和均質(zhì)(均質(zhì)：由不同的成分互不相溶而產(chǎn)生均勻的混合物)。均質(zhì)化后，將乙醇加入樣品中，RNA會(huì)與硅膠膜或磁珠結(jié)合，并通過洗滌的方式去除雜質(zhì)。該方法相較于有機(jī)萃取更省時(shí)，并且不需要苯酚。RNA產(chǎn)量可能沒有有機(jī)萃取方式來的高，但是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、DNA等殘留明顯減少。當(dāng)然，由于不洗滌，仍有可能發(fā)生胍和乙醇的殘留，對cDNA合成效率產(chǎn)生一定的影響。

通常有機(jī)裂解和硅膠吸附相結(jié)合，可以做到樣本充分裂解，RNA提取更加簡便、快速和高純度。

常見評估RNA質(zhì)量的方法有四種，分別是紫外光譜法(分光光度計(jì)測量)、核酸電泳、Qubit熒光測量和毛細(xì)管電泳分析法。

紫外光譜法是一種傳統(tǒng)且簡單的測量方法，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均配備分光光度計(jì)。通常會(huì)檢測三個(gè)值，分別是A230、A260和A280。

A230是鹽類、多糖、有機(jī)溶劑等最高吸收峰的吸收波長，包括胍、EDTA、TritonTMX-100、Trizol、乙醇、多糖等最高吸收峰均接近230 nm。

A260是核酸最高吸收峰的吸收波長，由于核酸結(jié)構(gòu)中的芳香堿基部分，包括嘧啶堿基（T、C、U）與嘌呤堿基（A、G）的最高吸收峰均在260 nm，因此A260值可用于核酸定量計(jì)算。

A280是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，蛋白質(zhì)中色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸與胍氨酸的芳香氨基酸鏈與有機(jī)化合物中的芳香性苯酚的最高吸收峰均接近280 nm。

其中A260/A280＞2.2表示RNA降解常為經(jīng)驗(yàn)判斷，并沒有文章驗(yàn)證依據(jù)。判斷RNA是否發(fā)生降解辦法是跑電泳進(jìn)行鑒定。

紫外光譜法雖然高效方便，但其也存在一定的不足。紫外吸光度可能會(huì)受到以下幾點(diǎn)的影響：

• 游離核苷酸的存在。吸光度不能區(qū)分核酸和游離核苷酸。并且游離核苷酸在 260 nm 處比核酸吸收更多，數(shù)值會(huì)受干擾，而非真實(shí)數(shù)據(jù)。

• 紫外吸光度測量無法區(qū)分同一樣品中的RNA和DNA。

• 純化核酸樣品中通常存在的污染物(例如蛋白質(zhì))有助于紫外吸光度讀數(shù)。

另一種常見的RNA質(zhì)量評估方法是瓊脂糖凝膠電泳。該方法可以判斷RNA樣本的降解情況、基因組殘留和蛋白殘留情況。

▲高質(zhì)量的RNA電泳會(huì)有三條比較明顯的條帶，分別是28S，18S與5S核糖體RNA條帶，并且28S與18S的條帶亮度之比大體為2：1。當(dāng)RNA出現(xiàn)降解時(shí)，條帶會(huì)呈現(xiàn)彌散狀

▲當(dāng)基因組DNA有殘留時(shí)，泳道上部會(huì)有明顯的高分子DNA條帶

▲當(dāng)存在蛋白殘留時(shí)，點(diǎn)樣孔中會(huì)有比較亮的著色成分

當(dāng)RNA樣本中存在基因組DNA(gDNA)殘留時(shí)，可能會(huì)在下游PCR實(shí)驗(yàn)或者下游熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。在熒光定量PCR中直接的表現(xiàn)是Ct值明顯偏小，且熔解曲線出現(xiàn)雙峰。

目前有三種方法可以避免RNA樣本中g(shù)DNA的干擾。其中的方法是做好引物設(shè)計(jì)，跨內(nèi)含子且不在單個(gè)外顯子模塊中設(shè)計(jì)上下游引物。

當(dāng)引物設(shè)計(jì)不可避免或已完成了引物合成，則可以在RNA提取時(shí)選取帶有g(shù)DNA去除功能的RNA提取試劑盒或在反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA時(shí)選用帶有g(shù)DNA去除功能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

在正式進(jìn)行cDNA合成之前，我們需要明確cDNA合成的模板是什么，是作用于RNA沉默和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的MicroRNA？還是涉及多個(gè)細(xì)胞過程的小型非編碼RNA？還是將DNA信息轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)產(chǎn)物氨基酸序列的mRNA？還是其他類型的RNA？不同的RNA合成cDNA所需要的引物會(huì)有所不同，應(yīng)按需調(diào)整。

以RNA為模板合成第一鏈cDNA的過程為反轉(zhuǎn)錄。該步驟是反轉(zhuǎn)定量中變化最大的一步，該步驟中可以使用隨機(jī)引物、Oligo dT或序列特異性引物，引物選擇在反轉(zhuǎn)錄效率、一致性和準(zhǔn)確性上有著重要的作用。

Oligo dT引物是常見反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的，因?yàn)槠鋵RNA具有特異性，并且可以從同一cDNA庫中分析許多不同的靶標(biāo)。然而，由于其總在轉(zhuǎn)錄本RNA的3'末端啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄，二級結(jié)構(gòu)的存在可能導(dǎo)致cDNA合成不完整。

隨機(jī)引物能夠產(chǎn)生大量的cDNA，其在熒光定量 PCR 中具有最高的靈敏度。同時(shí)隨機(jī)引物也是無poly A尾RNA的理想選擇，例如原核生物RNA。隨機(jī)引物在整個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本中退火，產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，從而能夠產(chǎn)生含有不同長度的cDNA。降解的RNA和復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)對隨機(jī)引物不會(huì)造成太大的影響。隨機(jī)引物可以提高產(chǎn)量，但單獨(dú)使用也會(huì)產(chǎn)生拷貝數(shù)被高估的風(fēng)險(xiǎn)。隨機(jī)引物和Oligo dT引物的組合通?？梢酝ㄟ^在同一反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)來以提高cDNA的質(zhì)量。

基因特異性引物具有最大的特異性，并且是反轉(zhuǎn)錄引物選擇中最為一致的。然而，這類引物沒有Oligo dT和隨機(jī)引物的靈活性，只產(chǎn)生靶基因產(chǎn)物所對應(yīng)的cDNA。

在正式測量cDNA濃度之前，可能需要了解一下，cDNA濃度是否需要測量？通常反轉(zhuǎn)錄后所獲得的cDNA產(chǎn)物是一個(gè)混合體系，其中包含cDNA、未反轉(zhuǎn)錄的RNA、游離的核苷酸(dNTP)、殘余的引物以及各類蛋白和鹽離子等成分，會(huì)干擾cDNA的吸光值，從而影響判斷。

尤其是dNTP，該成分對于紫外光譜的影響較大。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，反轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會(huì)使cDNA濃度的測定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致，qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1。

▲Nanodrop定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

▲qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1，且Ct值與 Nanodrop 定量結(jié)果無線性關(guān)系

cDNA濃度的測定受多因素影響，故可以選擇不進(jìn)行cDNA濃度的測定。另外同一批RNA濃度調(diào)整后，默認(rèn)同一批次做的反轉(zhuǎn)錄效率是一致的，cDNA和RNA投入量呈現(xiàn)線性正相關(guān)，cDNA的濃度高低后續(xù)可通過熒光定量PCR反應(yīng)中的內(nèi)參數(shù)據(jù)來反映。故而在進(jìn)行cDNA合成時(shí)，保證好高質(zhì)量無降解的RNA，即可獲取高質(zhì)量的cDNA及準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

以上是對如何獲取高質(zhì)量cDNA的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何獲取高質(zhì)量cDNA已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠，敬請期待哦。