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DNA甲基化是潛力的早篩及MRD的標(biāo)志物，基于NGS的甲基化檢測中，重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是DNA甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5%以上，但重亞硫酸鹽處理會導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷、片段化及解鏈。此外，一些低質(zhì)量或嚴(yán)重降解的DNA（cfDNA、ctDNA、FFPE DNA、古生菌DNA等）中也含有大量的DNA單鏈，采用常規(guī)雙鏈建庫，文庫轉(zhuǎn)化效率較低，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量差。而單鏈建庫可以大幅提高DNA原始分子的利用率，提高文庫的復(fù)雜性，在低起始量樣本的甲基化文庫和基因組文庫構(gòu)建中具有顯著的優(yōu)勢。
圖1. 甲基化單鏈建庫流程圖
甲基化轉(zhuǎn)化：重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理DNA，使未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U；
變性：雙鏈DNA變性為單鏈DNA；
3’接頭連接：TdT末端轉(zhuǎn)移酶催化單鏈DNA的3’羥基端加上同聚物尾巴（poly C），E.coli DNA Ligase 連接3’接頭；
二鏈合成：DNA Ploymerase I或Klenow Fragment進(jìn)行單鏈DNA互補(bǔ)鏈合成；
5’接頭連接：T4 DNA Ligase 連接5’接頭；
文庫擴(kuò)增：耐U高保真DNA聚合酶擴(kuò)增，獲取含有完整接頭序列的上機(jī)文庫。
翌圣通過ZymeEditor酶改造平臺對用于單鏈建庫的全套酶原料進(jìn)行性能提升及工藝優(yōu)化，用于單鏈建庫可顯著提高文庫轉(zhuǎn)化率，助力甲基化檢測。
圖2. 不同投入量gDNA建庫產(chǎn)量
圖3.不同投入量gDNA map率
圖4.不同投入量gDNA Dup率
對cfDNA及FFPE DNA樣本進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，使用翌圣全套建庫酶原料進(jìn)行單鏈建庫，結(jié)果顯示使用翌圣酶原料進(jìn)行單鏈建庫，文庫產(chǎn)量顯著優(yōu)于進(jìn)口品牌（圖5 A），map率（圖5 B）及Dup率（圖5 C）與進(jìn)口品牌相當(dāng)。
圖5. 不同樣本單鏈建庫產(chǎn)量、Map率及Dup率
單鏈建庫解決方案
| 產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
| 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 | Hieff® Mag DNA Methylation Bisulfite Kit | 12223ES |
| 3’端添加poly C | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase末端轉(zhuǎn)移酶 | 10302ES |
| 3’接頭連接 | E. coli DNA ligase (60 U/μL) | 14955ES |
| Taq DNA Ligase | 11051ES | |
| DNA二鏈合成 | DNA polymerase I | 12903ES |
| Klenow Fragment | 14458ES | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | 14460ES | |
| 5’接頭連接 | Hieff® Quick T4 DNA Ligase | 10301ES |
| PCR文庫擴(kuò)增 | Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase (1 U/μL) | 10145ES |
| 完整甲基化建庫試劑盒 | Hieff NGS® Methyl-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® V2 | 12221ES |
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