熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章？

在進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們通常會(huì)接觸并使用三種圖表，分別是擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線還有熔解曲線。曲線中出現(xiàn)的圖形分別代表著什么？對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有什么幫助？類似于熒光閾值、擴(kuò)增效率、Tm值定義是什么？發(fā)揮著什么樣的作用等等？了解這些元素背后的意義，將有助于我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、后續(xù)系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果~

在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，熒光定量PCR儀會(huì)對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，記錄的熒光信號(hào)也不斷的累積。熒光定量PCR擴(kuò)增曲線便是一條以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度變化為縱坐標(biāo)的熒光曲線。通常見到的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線會(huì)有兩種展現(xiàn)形式，分別是對(duì)數(shù)圖譜和線性圖譜，其中會(huì)包括基線、熒光閾值、CT值、指數(shù)增長(zhǎng)期等。

基線是指初始PCR的最初幾個(gè)循環(huán)中(通常為第3 至15個(gè)循環(huán))的信號(hào)水平，此階段的熒光信號(hào)變化極小。低水平的信號(hào)相當(dāng)于PCR反應(yīng)的背景或“噪聲”。該背景信號(hào)通常主要來自于反應(yīng)管中的反應(yīng)體系，隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，累積的熒光信號(hào)會(huì)超過背景信號(hào)，從而進(jìn)入下一時(shí)期?；€期通常情況下由儀器自動(dòng)劃定。

隨著PCR“一生二，二生四，四生八”的指數(shù)型擴(kuò)增，熒光信號(hào)也呈現(xiàn)相應(yīng)的指數(shù)型的熒光信號(hào)積累。該時(shí)期所有反應(yīng)試劑均有盈余，DNA聚合酶仍保持著高水平的活力，擴(kuò)增產(chǎn)物也相對(duì)較少，不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)引物的結(jié)合作用。該時(shí)期的PCR反應(yīng)具有高度特異性和精確性，只有在這個(gè)時(shí)期Ct值和初始模板量之間存在線性關(guān)系，故該時(shí)期也于定量分析。

理想的PCR反應(yīng)方程：Xn = X0*2n

現(xiàn)實(shí)的PCR反應(yīng)方程：Xn = X0* (1+En)n

（備注：n表示擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，X0表示初始模板量，Xn表示第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量，En表示擴(kuò)增效率）

在指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，En是一個(gè)固定值(理想狀態(tài)下100%)，其中的變量只有初始模板量X0和循環(huán)數(shù)，方便計(jì)算。

隨著原料的消耗、產(chǎn)物的積累、酶活的損耗等，DNA的擴(kuò)增不再呈指數(shù)擴(kuò)增，熒光信號(hào)的增長(zhǎng)也逐漸放緩。

由于底物耗盡，酶活性降低等因素，熒光信號(hào)不再呈指數(shù)型增加，趨于平穩(wěn)。在實(shí)際操作過程中，由于每個(gè)反應(yīng)孔中的每個(gè)樣品可能具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，每個(gè)反應(yīng)孔進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)會(huì)有所不同，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。

熒光定量PCR儀通常將熒光閾值自動(dòng)設(shè)置為基線期熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。其存在的目的主要是將相關(guān)擴(kuò)增信號(hào)從背景中區(qū)分出來，從而用于定量計(jì)算。熒光閾值遇到特殊情況可以手動(dòng)調(diào)整，但務(wù)必保證閾值線與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)位于指數(shù)增長(zhǎng)期。

CT值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在擴(kuò)增曲線圖上顯示為擴(kuò)增曲線與熒光閾值線交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。CT值可用于計(jì)算起始DNA拷貝數(shù)，研究顯示，CT值與靶標(biāo)的起始量成反比，起始量約多，CT值約小，反之亦然。靶標(biāo)起始量之間的差別通?？梢酝ㄟ^CT值粗略估算出來。靶標(biāo)起始量差了2倍的情況下，CT值的差異通常為1左右(21=2)；靶標(biāo)起始量差了10倍的情況下，CT值的差異通常為3.33左右(23.33=10)。

通常情況下將已知濃度的樣品(市面上購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品或自己構(gòu)建的質(zhì)粒)經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到一系列的CT值，以已知的稀釋梯度的濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，濃度所對(duì)應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)繪制曲線，即可得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線中的一些參數(shù)，可用于判斷相關(guān)實(shí)驗(yàn)樣本同樣靶標(biāo)的起始量或者評(píng)估反應(yīng)效率。

R2值又稱為擬合優(yōu)度，通常用來描述數(shù)據(jù)對(duì)模型擬合程度的好壞，表示橫坐標(biāo)自變量對(duì)縱坐標(biāo)因變量的解釋程度。理論上，R2要等于1，熒光定量實(shí)驗(yàn)中越接近1表示回歸擬合效果越好，一般熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線至少要求0.98以上。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可用于檢測(cè)擴(kuò)增效率。通常情況下，為了獲得準(zhǔn)確且可重現(xiàn)的結(jié)果，反應(yīng)的效率需盡可能接近100%，相當(dāng)于-3.32的斜率。當(dāng)反應(yīng)的效率在90%-110%時(shí)，相當(dāng)于-3.58至-3.10的斜率。

正如上方斜率所提到的，擴(kuò)增效率可用斜率來進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方程為：

效率 = 10（–1/斜率） – 1

理論上，在指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)中，PCR產(chǎn)物是2倍增加，反應(yīng)效率為100%，由100%=10（–1/斜率） – 1可推算標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.32，良好的擴(kuò)增效率需在90%至110%之間，其對(duì)應(yīng)的斜率在-3.58至-3.10之間。實(shí)際操作時(shí)，若擴(kuò)增效率低于90%，則表明擴(kuò)增效率偏低，偏低原因可能來自于引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；若擴(kuò)增效率高于100%，可能是梯度稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者出現(xiàn)類似引物二聚體的的非特異產(chǎn)物擴(kuò)增。當(dāng)擴(kuò)增效率不在90%至110%之間時(shí)，建議重新設(shè)計(jì)引物或探針。

上圖顯示了不同擴(kuò)增效率的熒光定量PCR反應(yīng)，該反應(yīng)初始模板量均為1拷貝。數(shù)據(jù)顯示擴(kuò)增效率差異在PCR反應(yīng)早期不會(huì)造成太大的影響。但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，在30個(gè)循環(huán)后，100%擴(kuò)增效率所得到的產(chǎn)物和擴(kuò)增效率為70%所得到的產(chǎn)物之間存在131倍的數(shù)量差異。因此，在循環(huán)次數(shù)相對(duì)較多且需要精確測(cè)試的實(shí)驗(yàn)中，保證好的擴(kuò)增效率尤為重要。

熔解曲線通常出現(xiàn)在染料法熒光定量PCR中，在擴(kuò)增階段，染料分子會(huì)結(jié)合于DNA雙螺旋的小溝區(qū)域，發(fā)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。而在熔解曲線階段，隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，結(jié)合染料分子的雙鏈DNA會(huì)解離成單鏈DNA，染料分子脫離DNA，熒光信號(hào)減弱。當(dāng)?shù)竭_(dá)雙鏈DNA解鏈溫度Tm時(shí)(即DNA雙鏈解鏈一半時(shí))，熒光信號(hào)急劇下降。以熒光強(qiáng)度和溫度或熒光變化和溫度變化作圖，即可清晰顯示熔解曲線的動(dòng)態(tài)變化。左圖為熒光和溫度作圖得到的原始熔解曲線，右圖為將溫度與熒光信號(hào)的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT)，得到的熔解曲線。通常使用右圖的熔解曲線進(jìn)行分析更加簡(jiǎn)便直接。

熔解曲線分析是一種簡(jiǎn)單、直接的分析方法，可用于分析熒光定量PCR反應(yīng)中的引物二聚體、其他非特異性擴(kuò)增等等，以確保反應(yīng)的特異性。DNA的解鏈溫度Tm受DNA長(zhǎng)度、GC含量以及是否存在錯(cuò)配堿基等因素的影響，因此還可以通過熔解曲線區(qū)分不同的PCR產(chǎn)物，不用再花時(shí)間和精力進(jìn)行凝膠電泳分析。

以上是對(duì)熒光定量PCR相關(guān)圖表的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，今后在實(shí)驗(yàn)圖表上分析具體實(shí)驗(yàn)情況更有把握啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠，敬請(qǐng)期待哦。