定向進化主要包括文庫構(gòu)建與突變體篩選兩部分，關(guān)鍵點則在于建立基因型和表型（即突變體性能）之間的物理對應關(guān)系。前兩期，我們已經(jīng)介紹了酶定向進化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)和突變體篩選技術(shù)，今天小翌來介紹基因型與表型的關(guān)聯(lián)。高效篩選方法的前提在于建立可靠的基因型和表型的關(guān)聯(lián)，這涉及兩個層面：首先符合預期表型的突變體的基因型可被回溯，即建立氨基酸序列和基因信息之間的聯(lián)系；其次，突變體相比于親本的表型變化能被設備或肉眼捕捉，最好能夠量化展示突變體性能提升的程度。
依賴物理空間或分子互作的直接關(guān)聯(lián)突變體的遺傳物質(zhì)和蛋白存在物理聯(lián)系的關(guān)鍵在于將二者鎖定在固定的空間內(nèi)，酶反應引起的物化性質(zhì)變化作為篩選的依據(jù)，同一空間內(nèi)的遺傳物質(zhì)則作為突變體酶的分子標簽。體內(nèi)篩選所用的微生物細胞是天然存在的的物理空間，符合期望的表型能直接回溯到相應基因型，并直接獲得可持續(xù)繁殖的個體。CSR、FADS技術(shù)中的微液滴則是在細胞外再構(gòu)造了一層物理屏障，確保細胞破碎后其DNA和蛋白依然共存。而對于以無細胞反應系統(tǒng)為基礎的液滴篩選技術(shù)（圖1），缺少了微生物這個“內(nèi)包裝”，均相溶液中核酸（mRNA或DNA）和蛋白則只能依賴分子間的相互作用而直接偶聯(lián)（如依賴嘌呤霉素和嘌呤霉素連接子建立聯(lián)系），形成類似mRNA-核糖體-蛋白三元復合物的結(jié)構(gòu)，確保酶和相應的核酸一一對應。
依賴克隆編碼及備份的間接關(guān)聯(lián)另一類方式則是將突變體單克隆預先備份，突變體酶性能評價結(jié)束后通過試管編號回溯到相應的種子液，進行再培養(yǎng)和后續(xù)測試。而在液滴技術(shù)領(lǐng)域，隨著設備準確度、速度、智能化程度的提升，液滴編碼標記和單液滴分離技術(shù)也將可以實現(xiàn)FADS系統(tǒng)中的液滴的備份。
圖1. 酶反應過程監(jiān)測
（圖片來自：doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.001）
高效檢測讓篩選事半功倍！
酶的種類千差萬別，不同酶又有多樣化的性能提升需求，因此定向進化篩選的標準是需要精確、客觀、容易量化的，最重要的是性能變化能直接或間接地被鑒別。
在體內(nèi)篩選系統(tǒng)中，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的酶蛋白的性能變化能夠轉(zhuǎn)化為報告基因的水平差異，如涉及轉(zhuǎn)錄的甲基化酶、RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子（圖1c1）、調(diào)控因子，涉及翻譯的核酶、tRNA及tRNA合成酶。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子需要與特定的代謝中間產(chǎn)物協(xié)同作用（如LacZ和半乳糖、AraC和阿拉伯糖），這些小分子涉及的代謝途徑相關(guān)酶，也有潛力在報告基因的基礎上建立胞內(nèi)篩選體系。核糖開關(guān)是一段特殊的RNA序列，可在小分子的誘導下發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的改變，這類小分子同樣可以關(guān)聯(lián)到特定的代謝途徑，以核糖開關(guān)下游的報告基因的表達情況指示途徑中酶的性能變化（圖1c3、圖1c4）。
產(chǎn)物是最佳的酶反應標志物，在體外篩選體系中，產(chǎn)物可直接用質(zhì)譜設備進行定量（圖1e），或監(jiān)測產(chǎn)物積累引起的反應液濁度、pH、電勢、熒光強度的變化（圖1a&d）。然而，在高通量篩選時體系內(nèi)的信號常會受到細胞碎片和內(nèi)容物的干擾，微液滴內(nèi)極低的產(chǎn)物總量也會對設備的靈敏度帶來較大考驗。因此，一些特異性識別、標記技術(shù)和級聯(lián)放大策略被用于輔助突變體的篩選。適配體是一段核酸序列（DNA或RNA），折疊為特殊的二級結(jié)構(gòu)即可特異性識別并結(jié)合目標分子，甚至通過形成穩(wěn)定的復合物而激發(fā)熒光（圖1c5），特征性地被設備識別進而提高檢測的特異性和靈敏度。適配體也可以作為RNA聚合酶的反應物，直接指示突變體的活性（圖2）。應用于DNA產(chǎn)物檢測的標記基團則可通過多種組合方式測試聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶的活性，底物結(jié)構(gòu)或完整度的變化而引起的熒光基團和淬滅基團空間距離的變化，讓熒光基團有潛力發(fā)出熒光而被設備捕獲（圖3）。
圖2. RNA適配體
（圖片來自：doi: 10.1016/j.saa.2022.121760.）
圖3. FRET定量檢測DNA
（圖片來自：doi: 10.1021/acssynbio.9b00103.）
DNA的序列組成決定了酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)與催化性能，優(yōu)勢突變體與相應基因型的物理聯(lián)系則是人們最終破譯氨基酸序列的關(guān)鍵。至少在高效、便捷的蛋白質(zhì)測序技術(shù)出現(xiàn)之前，核酸和蛋白的一對一關(guān)聯(lián)對酶的定向進化來說是的。到這，酶定向進化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)、突變體篩選技術(shù)、基因型與表型的關(guān)聯(lián)已經(jīng)介紹完了?？傊咄亢Y選對于充分發(fā)揮定向進化的潛力至關(guān)重要，但目前與高效篩選（即快速、準確、靈敏）相匹配的信號放大策略及設備的開發(fā)仍有巨大的提升空間。相信隨著酶反應機理及檢測技術(shù)研究的不斷推進，未來定向進化的技術(shù)將能夠更快實現(xiàn)迭代。
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