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關(guān)于USER酶混合物的應(yīng)用，看這篇就夠了！

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年11月05日 21:18

尿嘧啶特異性切除試劑（Uracil-Specific Excision Reagent , USER）是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸內(nèi)切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。UDG識別ssDNA或dsDNA上的dU堿基并形成AP位點(diǎn)，但磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能夠使AP位點(diǎn)的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，USER酶混合物能在DNA的dU位置產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口，適用于ssDNA、dsDNA及環(huán)狀DNA，可應(yīng)用于

RNA鏈特異性文庫構(gòu)建；
尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克?。║SER-LIC）；
TALE基本單位的組裝；
單細(xì)胞多個(gè)cDNA串聯(lián)建庫。

圖1. 切除dUTP示意圖

Uracil-Specific Excision Reagent的應(yīng)用

RNA鏈特異性文庫構(gòu)建

RNA測序（RNA-seq）已成為全轉(zhuǎn)錄組水平研究差異基因表達(dá)和mRNA差異剪接的工具，具有更準(zhǔn)確、可重復(fù)、廣泛和可靠的特點(diǎn)。RNA-seq的基本流程包括：提取RNA、建立cDNA文庫、上機(jī)擴(kuò)增測序、數(shù)據(jù)分析。其中RNA-seq文庫構(gòu)建包括常規(guī)建庫和RNA鏈特異性建庫兩種方法。在常規(guī)mRN建庫的流程中，由于我們在雙鏈cDNA的兩端加上的接頭是對稱的，這樣得到的文庫在測序后，無法判斷測出來的reads是來自正鏈還是負(fù)鏈。為了避免普通RNA-seq無法區(qū)分轉(zhuǎn)錄本方向的問題，后來出現(xiàn)了鏈特異的文庫構(gòu)建方法。鏈特異性RNA-seq保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負(fù)鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測更準(zhǔn)確。如圖2所示，利用dUTP標(biāo)記cDNA二鏈，USER酶混合物使標(biāo)記鏈被降解，可以實(shí)現(xiàn)鏈特異性RNA-seq文庫構(gòu)建。

技術(shù)路線：

使用引物合成RNA對應(yīng)的cDNA第一鏈；

使用dUTP取代dTTP合成cDNA的第二條鏈；

末端修復(fù)、3’加A、接頭連接；

去除含dUTP的cDNA鏈：用USER酶混合物處理，將含有dUTP的cDNA鏈去除，留下cDNA一條反鏈；

PCR 擴(kuò)增，上機(jī)測序。

圖2. 常規(guī)RNA建庫與鏈特異性文庫構(gòu)建對比[1]

尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克?。║SER-LIC）

USER-LIC是一種不依賴限制酶切位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)無痕克隆以及多片段同時(shí)組裝的新型體外重組克隆。USER-LIC主要是通過USER酶混合物特異性識別和刪除擴(kuò)增的雙鏈DNA片段中的dUTP，從而實(shí)現(xiàn)重疊DNA序列長度的可控。

技術(shù)路線：

擴(kuò)增：用含dUTP的引物擴(kuò)增目的片段和載體；

切除dUTP：將得到的兩種線性片段用USER酶混合物處理，使它們暴露互補(bǔ)的粘性末端；

連接與轉(zhuǎn)化：將帶有互補(bǔ)粘性末端的兩種線性片段混合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過篩選獲得目標(biāo)質(zhì)粒。

圖3. 克隆示意圖[2]

助力TALE技術(shù)，構(gòu)建TALE基本單位

TALE技術(shù)（Transcription activator-like effector , TALE）是一種熱門的基因編輯工具，能夠精準(zhǔn)編輯DNA。TALE的基本單位是一個(gè)可以識別不同堿基的蛋白domain，一個(gè)domain可以識別一個(gè)堿基，所以要構(gòu)建一個(gè)識別多個(gè)連續(xù)DNA堿基的TALE就需要多個(gè)對應(yīng)的基本蛋白domain。使用USER-LIC的方法，可以高效地合成這些基本單元，然后將它們有序組裝成最終的TALE工具。這種技術(shù)在低脫靶率等方面具有優(yōu)勢，被廣泛用于各種基因編輯工具的開發(fā)。

技術(shù)路線：

擴(kuò)增：使用含有dUTP的引物擴(kuò)增每個(gè)特定的TALE基本單位的編碼基因；

切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在每個(gè)基本單位的編碼基因DNA兩端保留一段特定的粘性末端；

組裝：這些粘性末端按照預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的TALE工具。

圖4. 基于尿嘧啶切除克隆的TALE組裝示意圖[3]

助力HIT-scISOseq技術(shù)，將單細(xì)胞多個(gè)cDNA串聯(lián)建庫

HIT-scISOseq技術(shù)由華大基因唐沖博士團(tuán)隊(duì)和中山大學(xué)眼科中心眼科國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉奕志院長團(tuán)隊(duì)共同開發(fā)，該技術(shù)利用USER酶混合物在cDNA兩個(gè)末端產(chǎn)生粘性末端，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞多個(gè)cDNA串聯(lián)建庫，結(jié)合PacBio平臺（CCS）測序，以實(shí)現(xiàn)高通量和高精度的單細(xì)胞RNA亞型測序研究。

技術(shù)路線：

獲得單細(xì)胞cDNA：借助10X Genomics 平臺，獲得單細(xì)胞全長cDNA；

擴(kuò)增cDNA：利用生物素化的含dUTP的PCR引物對全長cDNA進(jìn)行擴(kuò)增；

捕獲cDNA：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴(kuò)增的生物素化的cDNA；

切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在cDNA的兩個(gè)末端產(chǎn)生粘性末端；

連接與測序：使用DNA連接酶連接多個(gè)cDNA構(gòu)建CCS文庫后進(jìn)行長讀長測序。

圖5. HIT-scISOseq單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術(shù)流程[4]

翌圣Uracil-Specific Excision Reagent

翌圣Uracil-Specific Excision Reagent（Cat#14537ES）由翌圣生物分子酶改造平臺———ZymeEditor™經(jīng)過重組表達(dá)獲得的Endo VIII（Cat#14536ES）與UDG（Cat#14455ES）的混合酶，無核酸酶、RNase殘留，低宿主殘留，適用于dUTP切除、USER-LIC、RNA鏈特異性建庫以及單細(xì)胞cDNA串聯(lián)建庫等領(lǐng)域。

數(shù)據(jù)展示

dUTP切除效果與進(jìn)口品牌N*一致

分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）與進(jìn)口品牌N*的同類產(chǎn)品（1 U/μL）切除10 pmol含dUTP的雙鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進(jìn)口品牌N*的切除效果一致。

圖6. dUTP切除效果對比圖

USER-LIC效果優(yōu)于進(jìn)口品牌N*

分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）和進(jìn)口品牌N*的同類產(chǎn)品（1 U/μL）連接600bp DNA片段構(gòu)建載體，并導(dǎo)入到大腸桿菌中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，結(jié)果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent應(yīng)用于USER-LIC效果優(yōu)于進(jìn)口品牌N*。

圖7. 菌落數(shù)對比

客戶反饋

RNA鏈特異性建庫性能與進(jìn)口品牌N*一致

客戶測試翌圣14537ES與進(jìn)口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能，擴(kuò)增曲線表明翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進(jìn)口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能一致。

圖8. qPCR擴(kuò)增曲線

相關(guān)產(chǎn)品推薦

應(yīng)用	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
dUTP切除，USER-LIC，RNA鏈特異性建庫	Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL)	14537ES
DNA損傷修復(fù)研究	Endonuclease VIII (10 U/μL)	14536ES
PCR防污染	Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL	14455ES

參考文獻(xiàn)

[1] Zhao S, Zhang Y, Gordon W, et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 2015 Sep 3;16(1):675. doi: 10.1186/s12864-015-1876-7.[2] Annaluru N, Muller H, Ramalingam S, Kandavelou K, London V, Richardson SM, Dymond JS, Cooper EM, Bader JS, Boeke JD, Chandrasegaran S. Assembling DNA fragments by USER fusion. Methods Mol Biol. 2012;852:77-95. doi: 10.1007/978-1-61779-564-0_7. PMID: 22328427.[3] Zhou J, Wang J, Chen F, Zhuang Z, Chen M, Yang Y, Luo X, Tang C, Zhou X, Chi Y, Wang J, He Y, Zhang K, Zou Q. Improved USER cloning for TALE assembly and its application to base editing. PLoS One. 2023 Aug 4;18(8):e0289509. doi: 10.1371/journal.pone.0289509. [4] Shi, ZX., Chen, ZC., Zhong, JY. et al. High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing. Nat Commun 14, 2631 (2023).

相關(guān)產(chǎn)品

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