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給各位小伙伴們推薦精品之前，小翌先給大家出一道最近小翌碰到的問題╰(*°▽°*)╯
問：已知Taq DNA酶的最適變性和退火時間為30秒，最適延伸速度是60秒/kb，推薦循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)，在克隆實驗中小翌合成5 kb長的DNA片段理論上需要多久呢？
A． 理論上大概要3個小時左右
B． 理論上大概要4個小時左右
C． 理論上大概要5個小時左右
D． 理論上3分鐘，安排師弟做(???)
答案
B：預(yù)變性5 min+(變性30s+退火30s+延伸5min)×35+終延伸10min=225min
實際上小翌用這類Taq DNA酶合成5 kb的片段時，都不止4個小時，PCR儀器本身還有自己的升降溫時間。試想一下，合成5 kb大小的DNA片段加上電泳驗證，小翌要花一個下午才能確認(rèn)(。_。)。除此之外，還有個潛在的風(fēng)險，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小對了，序列不對，有部分堿基突變！
為避免這種情況的發(fā)生，辦法是用一個能又快又好合成DNA片段的DNA合成酶(安排小翌的師弟做)。目前出現(xiàn)了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真DNA聚合酶相比于Taq DNA 聚合酶有所不同，兩者最大的區(qū)別在于前者具有強(qiáng)校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯誤插入的核苷酸。當(dāng)出現(xiàn)錯配的核苷酸時，DNA合成會因為錯誤的匹配而暫時停止，期間高保真DNA聚合酶將切除錯配的核苷酸并使用正確的核苷酸進(jìn)行替換。
衡量不同高保真DNA聚合酶校正功能的指標(biāo)是保真度，保真度通常用錯配率的倒數(shù)表示(保真度=1/錯配率)，指的是發(fā)生錯配的核苷酸數(shù)量與合成的總核苷酸數(shù)的比值，錯配率越低則表示保真度越好。
DNA聚合酶保真度的檢測方法多種多樣，例如藍(lán)白班篩選鑒定、一代測序和二代測序等，使用不同的檢測方法結(jié)果也會不一樣。
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix
高保真好：低錯配率，高GC易突變序列中堿基錯配比231/300000
擴(kuò)增速度快：延伸速度快至5 sec/kb，省時高效
適用性廣：可覆蓋20-80%GC含量的基因，耐受小鼠裂解物和20%的血液
穩(wěn)定性好：37℃下存放7天，不影響產(chǎn)品性能
快速簡便：只需加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增，帶有上樣染料，可直接電泳
以不同物種基因組為模板，選取6段GC rich、極易發(fā)生堿基突變/丟失的片段進(jìn)行擴(kuò)增，將各自PCR產(chǎn)物克隆至載體，并對每種序列挑取100個單克隆進(jìn)行測序以確認(rèn)堿基序列錯配/突變情況。結(jié)果顯示10164ES發(fā)生堿基錯配/突變的比例優(yōu)于國內(nèi)外品牌試劑。
使用10164ES和不同產(chǎn)品均以5 sec/kb的延伸速度從100 ng人基因組模板擴(kuò)增不同長度片段（0.4-10 kb），延伸時間均要求為5 sec/kb。結(jié)果顯示，10164ES在10kb以內(nèi)的片段均可以5 sec/kb的延伸速度擴(kuò)增。Marker: Yeasen 10510ES。
使用10164ES從人gDNA模板中擴(kuò)增23-76% GC含量片段，延伸時間設(shè)置5 sec/kb。結(jié)果顯示，產(chǎn)品擴(kuò)增特異性良好，能兼容不同GC含量片段擴(kuò)增。Marker: Yeasen 10510ES。
可兼容不同類型的模板
使用10164ES從不同樣本中擴(kuò)增不同長度片段，延伸時間設(shè)置5-10 sec/kb。結(jié)果顯示本產(chǎn)品擴(kuò)增特異性良好，能兼容不同模板的不同片段擴(kuò)增。
圖解：1.小鼠gDNA 1 kb；2.小鼠gDNA 2 kb；3.小鼠gDNA 6 kb；4.玉米gDNA 1 kb；5.水稻gDNA 2 kb-A；6.水稻gDNA 2 kb-B；7.人293細(xì)胞cDNA 1 kb；8.人293細(xì)胞cDNA 2 kb ；9.人293細(xì)胞cDNA 3 kb；10.人293細(xì)胞cDNA 12 kb；11.大腸桿菌菌液8 kb；12.大腸桿菌菌液16 kb；13.水稻gDNA 10 kb-A；14.水稻gDNA 10 kb-B；15.水稻gDNA 10 kb-C；16.水稻gDNA 20 kb-A；17.水稻gDNA 20 kb-B；18.人血液直擴(kuò)3 kb。Marker: Yeasen 10510ES。
動物gDNA-120bp-50%GC
客戶評價：PCR過程速度快，條帶合適，可在瓊脂糖電泳中直接上樣。進(jìn)口N品牌的條帶偏上，可能是自身的buffer影響，且未添加loading buffer，該產(chǎn)品可替代目前我的實驗方案中的高保真酶。
客戶評價：與進(jìn)口T品牌相比，克隆條帶更加清晰單一，整個PCR時間也更快，跑膠時不用再額外加染料，非常方便快捷。
客戶評價：與國產(chǎn)V品牌相比，效果相當(dāng)，個人感覺更佳。
客戶評價：效果很好，條帶清楚。回到開頭的問題，若小翌使用這款5秒/kb的快速高保真PCR Mix擴(kuò)增5 kb的DNA片段用于克隆，理論上大概需要多久？
答案是~
預(yù)變性30s+(變性10s+退火5s+延伸25s)×35+終延伸2min=25min50s<<225min ?(`?′)? 省時間的同時還減少了錯配情況的發(fā)生!
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
TA/平末端通用高效拓?fù)淇寺?/span> | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
平末端拓?fù)淇寺?/span> | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
平末端拓?fù)淇寺?，不含多克隆位點(diǎn) | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit | 10910ES20 | 20 T |
單片段同源重組克隆 | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit | 10911ES20/50 | 20/50 T |
單多片段通用同源重組 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit | 10922ES20/50 | 20/50 T |
常規(guī)克隆感受態(tài) | TOP 10 Chemically Competent Cell | 11801ES80 | 10×100μL |
常規(guī)克隆感受態(tài) | DH5α Chemically Competent Cell | 11802ES80 | 10×100 μL |
快速克隆感受態(tài) | DH5α Fast Chemically Competent Cell | 11803ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)克隆感受態(tài) | BL21(DE3) Chemically Competent Cell | 11804ES80 | 10×100 μL |
快速PCR | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1/5×1 mL |
常規(guī)條帶分離 | Agarose瓊脂糖 | 10208ES60 | 100 g |
安全無毒核酸染料 | YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water) | 10202ES76 | 500 μL |
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