點(diǎn)擊序列如智人KIR3DL2蛋白的mRNA序列（KIR3DL2基因），進(jìn)入界面后會(huì)給出該基因的來源物種、詳細(xì)名稱、功能描述、文獻(xiàn)出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點(diǎn)擊右上角的“Send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。

圖2. NCBI基因序列下載

獲得目的片段后，根據(jù)同源重組原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，GC含量40-60%，以保證片段與載體充分接觸并進(jìn)行重組?？梢酝ㄟ^翌圣“支持中心”的“同源重組引物設(shè)計(jì)”點(diǎn)擊進(jìn)入，或者直接點(diǎn)擊無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件  進(jìn)行設(shè)計(jì)引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點(diǎn)），生成引物，如圖3、4所示。

圖3. 翌圣設(shè)計(jì)軟件

圖4. 翌圣引物設(shè)計(jì)流程

值得注意的是，多個(gè)目的片段插入的雙酶切位點(diǎn)，實(shí)際添加到第一個(gè)片段的5’端和最后一個(gè)片段的3’端，中間片段不含有設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)。通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES）PCR擴(kuò)增目的片段與載體。

當(dāng)設(shè)計(jì)完目的片段后，需要對載體和片段進(jìn)行模擬連接，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性?？梢允褂肧napgene軟件模擬。以pUC19為載體，KIR3DL2基因?yàn)椴迦肫?，進(jìn)行克隆連接模擬。選擇“Actions”—“Gibson Assembly”—“Insert Fragment”，輸入相應(yīng)的插入片段和載體序列，如下圖5所示，即可生成連接后的載體。點(diǎn)擊新生成載體的“History”可以模擬載體與片段連接的具體步驟，如圖6所示。

圖5. Snapgene同源重組模擬流程

圖6. Snapgene同源重組模擬圖

模擬步驟后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（Cat#10923ES）連接目的片段，該試劑盒滿足6 μL小體系、10 ng低濃度載體與片段的連接，菌落數(shù)多，克隆陽性率高，客戶反饋效果好，如圖7所示。

實(shí)驗(yàn)信息：載體大小：5369 bp；目的片段大?。?589 bp。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖7. 10923ES在10 μL小反應(yīng)體系下，低濃度載體（30 ng）連接單片段，陽性率100%。A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段PCR鑒定電泳圖，泳道1-5分別為菌落1，菌落2，陰性對照，陽性對照（基因組作為模版），陽性對照（PCR純化片段作為模版）。（上海交通大學(xué)）

除了上述基礎(chǔ)的分子克隆技術(shù)應(yīng)用工具外，還有如紐約大學(xué)研究人員開發(fā)的gRNA在線設(shè)計(jì)軟件    ，用于設(shè)計(jì)CRISPR-Cas13的gRNA引物等。分子克隆應(yīng)用工具多種多樣，應(yīng)用好工具，能為我們的實(shí)驗(yàn)添磚加瓦。小翌在這里祝您實(shí)驗(yàn)順利，一氣呵成！關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期繼續(xù)帶來分子克隆方面的知識(shí)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~