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同類(lèi)產(chǎn)品
一種簡(jiǎn)單的微環(huán)DNA制備與純化方法
宮頸癌（CC）是流行的癌癥之一，由人乳頭瘤病毒（HPV），也就是高危基因型HPV-16和HPV-18引起。持續(xù)感染后，HPV16/18編碼E6和E7腫瘤蛋白，分別負(fù)責(zé)抑制和降解p53和pRB腫瘤抑制蛋白。
過(guò)去幾年人類(lèi)一直在探索基因療法用于治療此類(lèi)不治之癥。Minicircular DNA（mcDNA）由于沒(méi)有原核序列，能最大程度的減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后原核元件對(duì)轉(zhuǎn)染效果和基因組的影響，因此被認(rèn)為是一種很有前途的載體。然而，其實(shí)現(xiàn)的生物技術(shù)過(guò)程涉及很多步驟，這對(duì)制藥行業(yè)來(lái)說(shuō)就會(huì)比較昂貴。
為了簡(jiǎn)化步驟，使mcDNA的制備方法更加簡(jiǎn)單可行，貝拉大學(xué)健康科學(xué)研究中心、快速和可持續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中心和賽多利斯公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)了一種新的制備方法，該方法使用Sartoclear Dynamics® Lab（硅藻土與負(fù)壓濾器組合套裝）直接過(guò)濾并去除所有細(xì)胞碎片和沉淀的雜質(zhì)，并結(jié)合使用膜層析柱Sartobind Q75 進(jìn)行純化作為第二步以去除 RNA。
結(jié)果
1 用Sartoclear Dynamics® Lab處理粗裂解液的結(jié)果比較
這種方法僅需的一個(gè)過(guò)濾步驟就可快速獲得澄清的裂解物，而不是像傳統(tǒng)方法那樣使用有機(jī)溶劑和高鹽并進(jìn)行三個(gè)離心的繁瑣過(guò)程。
2 使用Sartobind® Q75膜（季銨配體）進(jìn)行純化（季銨鹽配體）
用10mM Tris，0.1M EDTA，pH8.0（基礎(chǔ)緩沖液）進(jìn)行平衡；加載 30 mL用DE處理的裂解液。
大多數(shù)RNA雜質(zhì)在上樣步驟中被直接去除，通過(guò)增加NaCl離子強(qiáng)度，最終獲得了分離的DNA。
結(jié)論
-
使用Sartoclear Dynamics® Lab用硅藻土和過(guò)濾處理裂解物，與傳統(tǒng)方法相比，可以節(jié)省大量時(shí)間、資源和環(huán)境影響
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在對(duì)平衡和洗脫條件進(jìn)行一些初步研究后，Sartobind Q75層析膜可以成功去除RNA雜質(zhì)并分離純度高于90%的DNA
-
可繼續(xù)進(jìn)行一些研究以獲得分離的mcDNA載體并獲得最大產(chǎn)量
-本文摘自-
New Combined Approach to Simplify the Minicircular DNA Lysate and Directly Apply in Ion Exchange Membrane Chromatography
Mater. Proc. 2022, 8(1), 41; https://doi.org/10.3390/materproc2022008041
Published: 24 May 2022
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