無克隆長出或克隆數(shù)較少？

原因1：引物設(shè)計錯誤

①設(shè)計原則：同源臂（15-25bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除)+基因特異性引物（常規(guī)插入片段擴(kuò)增引物）。

②判斷方法：使用翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件核對

原因2：線性化載體與目的片段使用量錯誤

線性化載體與目的片段添加比例：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，最適載體使用量為0.03 pmol；最適目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

注：a、片段長度大于載體時，最適載體與目的片段使用量的計算方式應(yīng)互換，即目的片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做目的片段進(jìn)行計算。

b、線性化載體的使用量應(yīng)在50-200ng之間；目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在20-200ng之間。當(dāng)使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇或最高使用量即可。

原因3：載體與目的片段不純

推薦對線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。重組反應(yīng)體系中應(yīng)盡量避免金屬絡(luò)合劑（如EDTA）的帶入，故DNA純化產(chǎn)物不能使用TE進(jìn)行DNA保存，可溶解在pH8.0的ddH2O中保存。未純化DNA加入重組反應(yīng)體系內(nèi)的總體積不應(yīng)超過反應(yīng)體系體積1/5。

原因4：操作問題或試劑盒失效

推薦做試劑盒自帶的陽性對照實(shí)驗(yàn)，若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步排除是否為操作問題。

原因5：感受態(tài)細(xì)胞效率低，＜107cfu/μg

轉(zhuǎn)化效率檢測方法：轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），生長1000個菌斑，估算轉(zhuǎn)化效率為107cfu/μg。

假陽性—不含插入片段（空載）？

原因1：載體線性化 

判斷方法：將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示線性化 。

解決方案：若線性化 則需優(yōu)化酶切體系，例如提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等。

原因2：反應(yīng)體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒

判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊?。

解決方案：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。

假陽性—含不正確的插入片段？

原因1：PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物

可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。

解決方案：

①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；

②膠回收PCR產(chǎn)物；

③鑒定更多的克隆。

原因2：片段缺失

可能情況：載體或片段有多個同源重復(fù)序列。

解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對（如NCBI，VectorNTI等）。

菌落PCR無目的條帶？

原因1：菌落PCR引物錯誤

推薦使用載體的通用引物進(jìn)行菌檢，或至少使用一條通用引物。

原因2：PCR試劑Mix不穩(wěn)定，PCR體系或程序不合適

①更換新的PCR試劑盒

②優(yōu)化PCR體系、程序；

③提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；

④換成質(zhì)粒酶切鑒定陽性克隆。

原因3：載體線性化 

可能情況：目的片段引物+一端載體通用引物，或另一端目的片段引物擴(kuò)增無產(chǎn)物，而載體通用引物擴(kuò)增有產(chǎn)物，且大小符合空載。

解決方案：優(yōu)化酶切體系。例如提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等。

測序后插入片段有缺失或者突變？

原因1：PCR擴(kuò)增試劑的高保真性不強(qiáng)，導(dǎo)致位點(diǎn)缺失或突變

快速克隆試劑盒作用于15-25 bp的同源臂上，不會導(dǎo)致片段中間的位點(diǎn)缺失或者突變。

解決方案：更換保真性更高的PCR擴(kuò)增試劑盒

原因2：在切膠回收過程中，紫外下切膠過久導(dǎo)致突變

減少切膠時間，避免膠長時間暴露于紫外光下。

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