細胞檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

細胞檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過檸檬酸合成酶反應系統(tǒng)中釋放出巰基輔酶A，使用Ellman試劑后，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體等）檸檬酸合成酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

檸檬酸合成酶（citrate synthase；E.C. 2.3.3.1），又稱為檸檬酸生成酶（citrogenase），存在于所有生命體中，主要位于真核細胞線粒體內基質膜中，作為線粒體的定量標記之一。檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)（Tri Carboxylic Acid cycle；TCA cycle）或檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）或克雷伯循環(huán)（Krebs Cycle）的第一步，其催化來自于乙酰輔酶A（acetyl CoA）的二碳乙酸與四碳草酰乙酸（oxaloacetate）分子的縮合（condensation）反應，生成六碳檸檬酸，釋放出能量供細胞使用。檸檬酸合成酶為同源二聚體， 共有437氨基酸。每個亞體含有20個α螺旋體（α－helices）。基于草酰乙酸結合檸檬酸合成酶后，酶的構象發(fā)生改變，產生與乙酰輔酶A結合的機會，同時硫酯（thioester）水解，并釋放出巰基輔酶A（CoA－SH），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析檸檬酸合成酶的活性。檸檬酸合成酶反應系統(tǒng)為：

產品內容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應液（Reagent D）        毫升

底物液（Reagent E）             毫升

陰性液（Reagent F）          毫升

產品說明書              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離細胞

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或酶標板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

9． （選擇步驟）重復實驗步驟1至10，測讀新的樣品

五、計算樣品活性

六、 酶標板測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動96孔酶標板

6． 在37℃溫度下孵育3分鐘

7． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

8． 輕輕搖動酶標板

9． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

10． 活性計算：

注意事項

1． 本產品為20次（比色皿）和80次（酶標板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 可以使用純化線粒體（10微克）作為待測樣品

5． 建議使用比色皿測定

6． 樣品須澄清，至關重要

7． 加樣后3秒內比色測定

8． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)15分鐘

9． 比色測定后，比色皿須清洗

10． 樣本測定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

13． 檸檬酸合成酶單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠生成1微摩爾檸檬酸所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列脂肪酸代謝檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產品經鑒定檢測敏感