TUNEL檢測是一種用于檢測細(xì)胞凋亡（程序性細(xì)胞死亡）的方法。細(xì)胞凋亡是一種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，它在多種生理和病理情況下發(fā)揮作用，包括發(fā)育、組織修復(fù)和免疫應(yīng)答等。那么你知道Tunel檢測的實(shí)驗(yàn)步驟與注意事項(xiàng)嗎？讓我們一起來看看吧！

一、Tunel檢測的操作步驟

1. 脫蠟和組織復(fù)性

將組織在二甲苯中浸泡兩次，每次10-20分鐘。在100%乙醇中洗滌兩次，每次5分鐘。然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗滌3分鐘。

2. PBS洗滌和蛋白酶處理

用200-500 µL PBS洗滌樣品兩次，每次5分鐘。排除組織中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分鐘。

3. TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液/反應(yīng)混合物孵育

配制TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液。向每個(gè)樣品中加入50 µL反應(yīng)混合物，并在濕盒中避光下37℃孵育2小時(shí)。

4. PBS洗滌和DAPI復(fù)染

在PBS中將樣品洗滌3次，每次5分鐘。通過在1×DAPI中孵育10分鐘對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)染。

5. 觀察和拍照

將樣品在PBS中洗滌3次，每次5分鐘。然后加入水性封固劑或防淬滅溶液，封住蓋玻片。最后使用熒光顯微鏡觀察，并進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察，紅色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

二、注意事項(xiàng)

1. 設(shè)立陽性和陰性細(xì)胞對(duì)照：

陽性組：用DNase酶處理，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使3'-OH末端暴露。每次實(shí)驗(yàn)只需做一個(gè)陽性組。

陰性組：不加TdT酶，其余操作和實(shí)驗(yàn)組相同。

實(shí)驗(yàn)組：除了陽性組和陰性組，所有樣本均屬于實(shí)驗(yàn)組。

2. 選擇固定液：

建議使用4%多聚甲醛（PBS）進(jìn)行固定。不建議使用乙醇和甲醇作為固定液。不要選用含有甲醇的甲醛替代品，因?yàn)檫@會(huì)降低標(biāo)記效率，使熒光觀察困難。

3. 貼壁細(xì)胞處理：

貼壁細(xì)胞在加藥誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，形態(tài)會(huì)皺縮邊緣，貼壁粘附力降低。在對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)染色時(shí)，需要小心操作，避免吹打造成細(xì)胞脫落。特別是在多次洗滌細(xì)胞時(shí)，操作要小心輕柔。

4. 避光操作和孵育：

熒光基團(tuán)長期暴露在普通光照下，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重淬滅。

在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)盡量避光操作和孵育，以保證熒光觀察效果。

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