MX50047.3.1 v.A

 細(xì)胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 細(xì)胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過二肽化合物底物z-FR-AMC，在組織蛋白酶L抑制劑的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光產(chǎn)物氨甲基，即采用熒光法來測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時(shí)也是啟動(dòng)和傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)的替代機(jī)制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基（7-amido-4-methylcoumarin；激發(fā)波長(zhǎng)360nm；散發(fā)波長(zhǎng)460nm），來定量測(cè)定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）        毫升

 裂解液（Reagent B）        毫升

 緩沖液（Reagent C）        毫升

 底物液（Reagent D）         微升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）         微升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）和  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或比色皿：用于樣品熒光測(cè)定的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品制備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)360nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm，并置零

3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4． 分別加入xx微升  緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管

5． 移取xx微升  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻

6． 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻

7． 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻

8． 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻

9． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育60分鐘

6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）

7． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

3． 加入10微升待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育60分鐘

6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）

7． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)AMC濃度

五、 計(jì)算樣品實(shí)際活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品

2． 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔板

6． 在37℃溫度下孵育60分鐘

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）

9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)AMC濃度

10． 樣品實(shí)際活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融  

5． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

6． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

7． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定

8． 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

9． 組織蛋白酶B單位活性定義為：在37℃，pH 5.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個(gè)活性單位

10． 本公司提供系列組織蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感