DNA甲基化（5mC）可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，具有較好的穩(wěn)定性，是腫瘤液體活檢中一個價值的標志物。DNA甲基化檢測首先要進行甲基轉(zhuǎn)化，常見的分析方法是使用化學品或酶，以不同的方式與甲基化修飾的C及未修飾的C發(fā)生反應，從而將兩者區(qū)分開。目前有兩種策略，一種是通過將非甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，如重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法（BS-Seq）、EM-seq等；另一種是將甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，如TAPS等。

表1. 轉(zhuǎn)化技術(shù)對比

傳統(tǒng)的BS-seq被認為是甲基化分析的金標準，但存在明顯的限制：對DNA損傷大，影響模板利用率；非甲基化C轉(zhuǎn)化為T，基因組堿基不平衡；難以區(qū)分5mC和5hmC（另一種重要的甲基化類型，區(qū)分5mC和5hmC水平具有重要的臨床意義）。最近開發(fā)的酶學檢測技術(shù)解決了DNA損傷的問題，但還存在一定局限性，如DNA樣本需求量大、不能區(qū)分5mC和5hmC等。

為解決上述檢測問題，美國賓夕法尼亞大學研究團隊在Nature Chemical Biology上發(fā)表了題為“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution”的文章。其開發(fā)了一種DNA甲基化測序新方法：直接甲基化測序（DM-Seq）。DM-Seq可保持基因組堿基平衡：轉(zhuǎn)化過程中，非甲基化C與5hmC不變，5mC轉(zhuǎn)化為T；使用酶法處理：靈敏度高，不損害樣本；少量DNA樣本就可以在單堿基分辨率下對5mC進行分析，有望應用于液體活檢和早期癌癥檢測等。

圖1. DM-seq流程[1]

想要直接檢測5mC需要滿足兩個要求：保護基團有效轉(zhuǎn)移至未修飾的CpG；保護新生成的修飾堿基免受A3A介導的脫氨作用。CxMTase以carboxy-S-adenosyl-l-methionine（CxSAM）為底物生成的5cxmC可以抵抗酶促脫氨。使非甲基化C在轉(zhuǎn)化的過程保持為C，最終實現(xiàn)5mC的直接測序。

圖2. 抵抗酶促脫氨修飾堿基篩選

DM-Seq對5mC的直接檢測能夠更好地推動表觀遺傳測序在癌癥治療中的應用，但其中核心酶原料CxMTase無商業(yè)化產(chǎn)品，限制了其進一步的發(fā)展應用。翌圣緊跟科研前沿，借助翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點擊了解更多）酶改造及發(fā)酵、純化工藝平臺成為DNA羧甲基轉(zhuǎn)移酶（CxMTase，14555ES）商業(yè)化產(chǎn)品供應商，并可提供DM-seq全套酶原料，助力新技術(shù)研發(fā)及轉(zhuǎn)化。

低投入量即可高效完成DNA甲基化：

使用CxMTase對含有HpaII酶切位點的DNA模板進行甲基化修飾，該酶切位點受CpG甲基化影響，未修飾模板被切割，甲基化模板不切割；

酶切結(jié)果表明在CxMTase投入量為0.31 pmol時，模板DNA未發(fā)生切割，酶切阻斷，表明模板已被甲基化修飾。

圖3. CxMTase甲基化效率檢測 C1：DNA模板+HpaII；C2：DNA模板+水