原代細(xì)胞分離的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞。

1、胰蛋白酶 純化法

●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

●在組織碎片加入熱的全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2、膠原酶純化法

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

3、Dispase純化法

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）

●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

分離細(xì)胞后，第一次傳代需要注意的問題：

●傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性。

●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%，密度控制在80%左右最佳

●對(duì)于無血清培養(yǎng)基，需要降低胰蛋白酶使用量。