Q&A

Q: 類器官是由單一種類細胞組成的還是多細胞組織？
類器官（Organoids）指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。類器官并不是單一細胞組成的結(jié)構(gòu)，而是由具有干細胞性質(zhì)的起始細胞進行誘導(dǎo)后分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝成具有一定空間結(jié)構(gòu)，形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似的組織類似物。

Q: 類器官培養(yǎng)其樣本來源有哪些類型？
（1）多能干細胞來源的類器官包括：成體干細胞 (ASC)/多能性干細胞 (PSC) /以及誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。
（2）組織提取細胞來源的類器官，常見于腫瘤組織。

Q：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織進行3D培養(yǎng)嗎？
可以，但對凍存組織的大小有較高要求，且原代凍存組織及細胞活性會明顯下降，從而導(dǎo)致后續(xù)培養(yǎng)成功率大大降低。

Q：類器官如何進行凍存和復(fù)蘇？
類器官的最好選擇在P2-P5代次時凍存，此時類器官活性和分化性能都是優(yōu)狀態(tài)。類器官的復(fù)蘇可以參考細胞的復(fù)蘇方法

Q：培養(yǎng)的類器官尺寸需要進行控制嗎，太大會好嗎？
需要，最好控制在500um以內(nèi)，類器官內(nèi)部缺乏血管及氣液循環(huán)系統(tǒng)。

當(dāng)類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細胞就越多

Q：培養(yǎng)類器官除了使用基質(zhì)膠，還可以使用什么？
除了使用基質(zhì)膠，還可以使用①去細胞外基質(zhì)和其他衍生蛋白質(zhì)②合成水凝膠③工程化重組蛋白凝膠等進行替代。

Q:如何實現(xiàn)類器官的進行定向分化？
干細胞誘導(dǎo)分化的類器官早期發(fā)育過程受到多種信號通路的共同調(diào)控。在體外培養(yǎng)中，需要通過添加細胞因子來模擬這些信號通路的活動，以引導(dǎo)細胞在特定的方向分化。例如，通過Y27632、Activin A誘導(dǎo)可以將胚胎干細胞（PSCs）或多能干細胞（iPSC）分化為內(nèi)胚層細胞（EB），再通過Wnt3a、FGF-4和Noggin等因子調(diào)控信號通路，從而誘導(dǎo)干細胞細胞向特定方向分化。

Q：獲取臨床樣本，如何避免污染？
① 取材時盡量保證無菌取材；
② 提取前可以用含雙抗的pbs浸泡幾分鐘：常見與外界環(huán)境有接觸可能的胃、腸、膀胱等位置腫瘤建議用含3%-5%雙抗的pbs浸泡5-10min，其他常見腫瘤用含1%-2%雙抗的pbs浸泡5min左右；
③提取細胞過程中所用試劑均加1%雙抗及合適濃度的原代抗生素。

Q:腫瘤組織采集、保存、運輸注意事項
盡可能多采集腫瘤細胞含量高的腫瘤組織，并縮短組織樣本在空氣中暴露的時間，以減少污染概率；采集的腫瘤組織樣本盡快置于裝有專用樣本保存液的無菌管中，低溫（4 ℃左右）下快速運轉(zhuǎn)至檢測單位（盡量保證采樣后2~4 h內(nèi)送到）；

Q：病灶和癌旁培養(yǎng)出的類器官有區(qū)別嗎？腫瘤組織的取材部位有什么要求？
有差別，腫瘤本身具有異質(zhì)性，不同來源的類器官之間存在差異是很常見的現(xiàn)象，從形態(tài)上看，原發(fā)病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結(jié)構(gòu)，一般病灶形態(tài)上更加不規(guī)則一些。如果希望在建?；蛩幬锖Y選方面盡量減小誤差，可以在活性好的地方多位置取樣。

Q： 可用于腫瘤類器官藥物敏感性檢測的藥物類型？
臨床主要的抗腫瘤藥物類型可歸納為三大類，包括細胞毒物（化療藥物如紫杉醇、順鉑/卡鉑、5-FU 等）、靶向藥物（靶向EGFR、HER2、VEGFR等靶點的藥物）以及以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療藥物（PD-1抗體、PD-L1抗體等）

Q：PDO培養(yǎng)的成功率是多少？
不同類型來源的PDO在培養(yǎng)過程中的成功率略有不同，大部分的PDO培養(yǎng)成功率在63%至70%之間，甚至更高，達到90%，這跟組織本身活性相關(guān)性比較大。此外，臨床治療對于成功率的統(tǒng)計結(jié)果有一定影響。通過縮短樣本的離體時間和操作步驟，可以適當(dāng)提高成功率。

Q：冰凍組織可以用于類器官培養(yǎng)？
一般不建議組織冷凍保存，活率損失會比較大，但如果冷凍保存在-80℃條件下，最佳的類器官培養(yǎng)窗口是在保存后的6周內(nèi)，如果組織保存在液氮中，其保存時間可以更長但最好不要超過半年。

Q：原代細胞提取時，通常會混有成纖維細胞，應(yīng)如何處置？
（1）可以根據(jù)成纖維細胞貼壁不牢的特性，采用反復(fù)貼壁的方式去除大部分成纖維細胞。
（2）采用成纖維細胞去除試劑，但是否會影響類器官的培養(yǎng)還需要實驗驗證。

Q：培養(yǎng)腫瘤類器官需要多大原始腫瘤組織比較好？活檢樣本量足夠嗎？
手術(shù)組織所需的原始腫瘤組織大小通常應(yīng)大于2-3顆黃豆大??；若使用穿刺活檢方式獲取樣本，則至少需要2-3條穿刺樣本，而內(nèi)鏡活檢需要至少鉗取6顆以上腫瘤組織。

Q：樣本腫瘤組織偏小，培養(yǎng)的類器官數(shù)目不足以進行后續(xù)檢測，怎么辦？
由于腫瘤來源的類器官在傳代后可能會出現(xiàn)表型上的差異，一般不建議進行傳代。文獻中一般推薦將類器官的傳代控制在2-3代，并且最多不超過5代。如果細胞數(shù)目太少，經(jīng)過5代的傳代仍然無法滿足測試需求，可以考慮改變檢測方式，例如將96孔板換成更小的384孔板，甚至嘗試使用微流控芯片等更小的體系進行測試。

Q：腫瘤組織中會存在正常細胞嗎？怎么去除這些正常細胞？
會存在少部分正常細胞，首先是取材時盡量避免取到正常組織，其次，提取原代細胞后可以進行磁珠分選或流式分選后再進行類器官培養(yǎng)。極少量存在正常細胞時，對后續(xù)類器官建模培養(yǎng)影響不大，也可不去除。

Q：從腫瘤組織中提取原代細胞，為什么細胞呈紅色？
組織在體內(nèi)時供血豐富，存在較多紅細胞，不是很多的情況下不用處理，不影響類器官培養(yǎng)，較多紅細胞時可以適當(dāng)用裂紅液處理后再進行培養(yǎng)。

Q：類器官培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)有黑色小顆粒，如何去除？
黑色小顆粒大概率是雜質(zhì)或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：
1、將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進行反復(fù)清洗，達到稀釋雜質(zhì)的作用；
2、用無菌手術(shù)刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養(yǎng)基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質(zhì)

Q：類器官傳代有次數(shù)限制嗎，可以進行多少次傳代？
傳代次數(shù)一般由來源細胞性質(zhì)決定，大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月），培養(yǎng)基條件的選擇也可能會有一定影響，條件培養(yǎng)基一般會優(yōu)于合成因子培養(yǎng)基。

Q：腫瘤細胞系（如HepG2細胞系）可以培養(yǎng)成為PDO嗎？
PDO是復(fù)雜的自組裝結(jié)構(gòu)，單一細胞系形成的3D培養(yǎng)體系無法稱之為PDO，只能是稱為3D球狀態(tài)。

Q：類器官傳代的標(biāo)準(zhǔn)是什么？
依據(jù)類器官的發(fā)育狀況，不同類器官時間不同，通常5-10日、直徑100-200um左右可以傳代，有些發(fā)育慢的可能要數(shù)周才能發(fā)育到適合傳代狀態(tài)。

Q：活類器官數(shù)量如何進行計數(shù)
實驗時,取出已經(jīng)配置好的鈣黃綠素儲存液,加入鈣綠黃素溶液到培養(yǎng)基中至終濃度為0.2μmol/L。隨后在 37℃條件下孵育 60 min。到達時間后,用 PBS緩慢清洗掉帶有鈣綠黃素的培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基。用 490 nm 激發(fā)波長,515 nm 發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察類器官并拍照?；铑惼鞴僭跓晒怙@微鏡下顯示為綠色且邊緣清晰。對直徑>20μm的活類器官計數(shù)。

Q：類器官存活率的計算

類器官存活率按照公式進行計算:   X=(N活/N總)x100%     其公式中:
X——代表類器官存活率;
N活——代表活類器官數(shù)量;
N總——代表總類器官數(shù)量。

Q：鑒定類器官的方法有哪些？
最基礎(chǔ)的通過顯微鏡和H&E染色觀察類器官形態(tài)；進一步可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測該類器官是否表達相應(yīng)的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官與源組織的基因匹配度；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

Q：正常細胞是否也會生長為類器官？腫瘤類器官培養(yǎng)時怎么去除正常類器官？
正常細胞也可生長為類器官，去除正常類器方法：①依據(jù)HE鑒定結(jié)果的形態(tài)顯微鏡下手動篩選；②通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組分（細胞因子/小分子抑制劑等）進行篩選純化PDO；③將PDO分散為單細胞后進行流式或磁珠分選。

Q：進行藥敏實驗時，需要將PDO從基質(zhì)膠中消化下來嗎？
不需要，PDO需要有三維結(jié)構(gòu)才能模擬體內(nèi)情況。如果沒有基質(zhì)膠的支持，藥物敏感性實驗的準(zhǔn)確性將受到影響。一般溶解性藥物均可穿透基質(zhì)膠作用于類器官，但進行免疫殺傷實驗時，是需要去除基質(zhì)膠的。

Q：PDO實驗可以全代替動物模型（PDX）嗎？
能部分替代PDX，不可以全替代，動物模型可以更好的模擬藥物代謝、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移及一些更為復(fù)雜的病理過程。是PDC，PDO無法替代的。

Q：在培養(yǎng)過程中，PDO生長情況與之前相比異常，主要表現(xiàn)為生長周期變短，增殖迅速，這是什么原因？
外因：①這種異?？赡苁怯赡承╇s質(zhì)細胞（如成纖維細胞）的大量生長引起的。在這種情況下，建議進行切片染色并觀察，以確定是否存在這些細胞的污染再進一步去除；②培養(yǎng)基條件改變，某些因子或小分子的加入可以進一步激活PDO的增殖通路。

內(nèi)因：可能的基因突變。為了驗證這一點，最好進行測序，并將結(jié)果與初代PDO進行比對，以確定是否存在基因突變。

Q：怎樣檢測PDO對藥物的敏感性？
可以通過CCK8檢測、ATP細胞活性檢測、活死染色法等對類器官進行藥物敏感度檢測。檢測腫瘤類器官的ATP活力值是常用的方法。ATP是細胞內(nèi)最重要的能量分子，可以用來衡量細胞新陳代謝水平，反映活細胞的數(shù)目?；诮o藥對細胞ATP含量的影響，進一步利用分析軟件計算每組藥物方案的IC50值（被測藥物的半抑制濃度），來篩選出對腫瘤抑制藥物。

Q：PDO和腫瘤原代細胞的藥敏實驗濃度范圍相同嗎？
不相同，通常PDO的給藥濃度要高于原代細胞，在正式藥敏實驗時可以先進行預(yù)實驗分析。

Q：類器官一般長到什么程度可以用來進行藥物測試？
一般推薦藥物測試選用5代以內(nèi)的類器官，此時的類器官遺傳穩(wěn)定性和活性都是好的。

Q：類器官建立是否成功有怎樣的標(biāo)準(zhǔn)嗎？
①最早期的初步判斷：類器官的形態(tài)改變從細胞狀態(tài)分化出空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等形態(tài)。②通過鑒定特定的生物標(biāo)志物是否表達，并與組織切片的分布相似。進一步的可以進行測序分析以獲得更詳細的比對信息來判斷。

Q：類器官培養(yǎng)和普通細胞培養(yǎng)有何不同之處？
（1）細胞培養(yǎng)方式不同：類器官需要借助基質(zhì)膠或空間結(jié)果等支撐物來維持其三維結(jié)構(gòu)，而普通細胞培養(yǎng)則不需要；

（2）類器官的培養(yǎng)需要實現(xiàn)體外分化和自組裝，因此需要使用多種細胞因子的組合誘導(dǎo)，所需培養(yǎng)基成分相對復(fù)雜。而普通細胞培養(yǎng)通常只涉及單一類型的細胞，所以培養(yǎng)基成分相對簡單；

（3）細胞來源不同：類器官的細胞來源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養(yǎng)適用于培養(yǎng)多種類型人為篩選細胞。

Q：我培養(yǎng)出的3D球不知道是不是類器官，怎么判定與目標(biāo)組織具有一致性？
類器官鑒定方法包括HE染色、ICH、單細胞測序等多種方法，需要從形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)及分子遺傳學(xué)等多維度進行判定是否與目標(biāo)類器官或組織一致，如果是腫瘤類器官可以通過檢測標(biāo)志物判斷，下表節(jié)選自NCCN指南和相關(guān)文獻僅供參考：

Q: 按照文獻方法進行類器官培養(yǎng)，觀察到類器官的形態(tài)與文獻有差異，是什么原因？

首先，不同個體樣本來源差異和分型不同且也存在異質(zhì)性；其次，選用的細胞因子及一些小分子抑制劑的品質(zhì)是否有差異都有可能導(dǎo)致不同類器官分化形態(tài)。建議通過HE，IHC，基因測序等方法與源組織確定類器官形態(tài)與源組織是否具有一致性，并不一定局限于文獻形態(tài)。

Q：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？

需要，一般藥敏實驗要求dmso的體積含量小于0.5%。

Q：類器官怎么從基質(zhì)膠中回收？

①比較推薦：市售有類器官回收液（CAT#41421ES），可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

②低溫融解基質(zhì)膠，利用基質(zhì)膠本身性質(zhì)低溫使基質(zhì)膠軟化釋放類器官。

Q：在類器官回收時，會有不少類器官粘附在離心管壁，如何提高回收率？

收集后離心時用水平轉(zhuǎn)子離心機，可以適當(dāng)提高一點離心機轉(zhuǎn)速，一般300g左右離心力，轉(zhuǎn)速大概是1000-1200rpm。

參考文獻：

【1】王樹濱,高靜,朱宇等.類器官藥物敏感性檢測指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(2022年版)[J].中國癌癥防治雜志,2022,14(03):234-239.
【2】團體標(biāo)準(zhǔn)：T/CSCB 0014-2022，人腸癌類器官
【3】團體標(biāo)準(zhǔn)：T/CSCB 0013-2022  人腸道類器官
【4】Toshio,Takahashi.Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine.[J].Annual review of pharmacology and toxicology, 2018.DOI:10.1146/annurev-pharmtox-010818-021108.
【5】Yang H ,Wang Y ,Wang P , et al.Tumor organoids for cancer research and personalized medicine[J].Cancer Biology Medicine,2022,19(03):319-332.