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國際期刊 | 浙江大學(xué)平淵團(tuán)隊開發(fā)溶瘤病毒-T細(xì)胞嵌合體
溶瘤病毒治療，盡管具有針對腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制和殺傷能力，但其療效受到一些限制。這些局限性包括系統(tǒng)給藥時，病毒在腫瘤組織中的吸收不足，以及病毒可能導(dǎo)致免疫檢查點蛋白過度表達(dá)，從而抑制免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。腫瘤微環(huán)境對治療效果的影響也是一個關(guān)鍵因素。在微環(huán)境中，免疫檢查點蛋白如PD-L1的過表達(dá)可以降低免疫反應(yīng)，進(jìn)而減少治療效果。
為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，基因編輯技術(shù)，特別是CRISPR/Cas9，被提出用于破壞腫瘤細(xì)胞中的免疫檢查點基因。這種策略有望逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，從而提高治療效果。
然而，腫瘤靶向給藥仍然面臨挑戰(zhàn)，例如需要開發(fā)更有效的載體系統(tǒng)，以確保藥物能夠準(zhǔn)確地送達(dá)腫瘤部位。一種有前景的策略是將溶瘤病毒負(fù)載在具有腫瘤趨向性的免疫細(xì)胞表面，以實現(xiàn)病毒和細(xì)胞的同步給藥，這有望提高治療效果。此外，開發(fā)溶瘤病毒基因編輯治療策略，可以克服當(dāng)前溶瘤病毒治療存在的局限性，為腫瘤治療提供新的解決方案。為此，浙江大學(xué)藥學(xué)院平淵團(tuán)隊開發(fā)了一種名為ONCOTECH的新型治療方法，該方法作為一種結(jié)合病毒治療和細(xì)胞治療的技術(shù)，展現(xiàn)了良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該研究于2024年2月9日在線發(fā)表于Nature Biotechnology期刊(IF:46.9)，論文標(biāo)題為“An oncolytic virus–T cell chimera for cancer immunotherapy”。
在這項創(chuàng)新性的研究中，研究團(tuán)隊采取了一種方法，將腫瘤溶解病毒（具體來說是腫瘤溶解腺病毒，簡稱為OAs）與T細(xì)胞相結(jié)合，以期提升對癌癥的治療效率。具體來說，該方法(ONCOTECH)利用了一種攜帶Cas9基因和靶向PDL1 sgRNA的eOA病毒，通過精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)，下調(diào)腫瘤細(xì)胞中PDL1的表達(dá)，從而增強(qiáng)溶瘤病毒的療效。
此外，將eOA病毒裝載到T細(xì)胞表面，形成了一個復(fù)合體，實現(xiàn)了eOA病毒和T細(xì)胞的同步靶向給藥，這不僅增強(qiáng)了T細(xì)胞的治療效能，還改善了腫瘤免疫抑制微環(huán)境。ONCOTECH能夠降低腫瘤和免疫細(xì)胞上PDL1的表達(dá)，增加效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤，同時減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，這一系列作用共同提升了免疫治療的效果。
更進(jìn)一步，eOA病毒的感染能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放危險信號分子，激活免疫系統(tǒng)。同時，ONCOTECH還能夠促進(jìn)樹突細(xì)胞提呈腫瘤抗原，激活腫瘤浸潤T細(xì)胞，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的治療效果。
(圖片來自原文)
eOA 釋放的 Cas9 如何有效破壞腫瘤細(xì)胞 PDL1 基因？
在該研究中，研究人員設(shè)計了一種溶瘤腺病毒（OA），命名為eOA，該病毒攜帶了Cas9基因編輯系統(tǒng)以及針對PDL1基因的特定sgRNA。這一創(chuàng)新的基因編輯策略旨在直接破壞腫瘤細(xì)胞中的PDL1基因，從而提升免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的攻擊能力。
研究人員首先使用eOA感染腫瘤細(xì)胞，并觀察到Cas9蛋白及其伴隨的sgRNA被成功轉(zhuǎn)錄到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。通過T7E1基因編輯檢測，他們發(fā)現(xiàn)PDL1基因發(fā)生了預(yù)期的插入和缺失突變，這表明Cas9已經(jīng)準(zhǔn)確地編輯了目標(biāo)基因。
進(jìn)一步的Western blot檢測顯示，eOA感染后，腫瘤細(xì)胞中的PDL1蛋白表達(dá)顯著下降。此外，通過T7E1和Western blot檢測，研究人員還證實了eOA能夠在體內(nèi)環(huán)境中破壞腫瘤細(xì)胞的PDL1基因，并有效下調(diào)PDL1蛋白的表達(dá)。
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(圖片來自原文)
如何巧妙地將病毒顆粒裝載到載體 T 細(xì)胞膜上？
在該項研究中，研究人員采用了一種創(chuàng)新的技術(shù)手段，成功地將病毒顆粒有效裝載到了T細(xì)胞的表面。這一過程涉及了精心的設(shè)計和多個步驟：
研究團(tuán)隊首先利用脂質(zhì)擠出法，將工程化的腺病毒（eOA）封裝到表達(dá)MHC-I-卵清蛋白復(fù)合物的B16OVA細(xì)胞膜中，從而形成了被稱為M@eOA的復(fù)合體。
接下來，研究人員利用MHC-I-卵清蛋白復(fù)合物與OT-1 CD8+ T細(xì)胞上的TCR受體之間的特異性識別作用，實現(xiàn)了M@eOA復(fù)合體在OT-1 T細(xì)胞表面的錨定，進(jìn)而形成了T-M@eOA復(fù)合體。
值得注意的是，M@eOA是通過脂質(zhì)雙分子層錨定在T細(xì)胞膜上，而非通過共價鍵連接，這樣的方式確保了T細(xì)胞的功能不會受到影響。
當(dāng)T-M@eOA復(fù)合體到達(dá)腫瘤細(xì)胞并識別出腫瘤特異性抗原時，M@eOA能夠與T細(xì)胞競爭性地釋放到腫瘤細(xì)胞表面，并成功進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。這種基于抗原受體相互作用的生物物理方法，不僅能夠有效地將病毒顆粒裝載到T細(xì)胞膜上，而且為腫瘤靶向的病毒治療提供了新的策略和思路。
(圖片來自原文)
ONCOTECH如何增強(qiáng)體外抗腫瘤反應(yīng)？
免疫細(xì)胞死亡（ICD）標(biāo)記物的表達(dá)增加
當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)過T-M@eOA處理后，免疫細(xì)胞死亡（ICD）的標(biāo)記物，包括鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、熱休克蛋白70（HSP70）、ATP和HMGB1的表達(dá)水平顯著上升。這一現(xiàn)象表明T-M@eOA能夠誘發(fā)強(qiáng)烈的ICD效應(yīng)，從而激活免疫系統(tǒng)。
抗原提呈能力的增強(qiáng)
實驗顯示，經(jīng)T-M@eOA處理的腫瘤細(xì)胞上清液可以增強(qiáng)骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（BMDC）對MHC-I-卵清蛋白復(fù)合物的提呈能力。這意味著T-M@eOA能夠提升抗原提呈細(xì)胞的功能，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞增殖和效應(yīng)功能的增強(qiáng)
T-M@eOA能夠顯著促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，并提高其分泌干擾素γ和顆粒酶B等效應(yīng)分子的能力，這些都是評估T細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。
腫瘤球生長的抑制
在三維腫瘤球模型中，T-M@eOA能夠有效抑制腫瘤球的生長，這表明它能夠重塑免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤功能。
基因集富集分析
通過對T-M@eOA處理后的腫瘤組織進(jìn)行RNA測序和基因集富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)病毒蛋白與細(xì)胞因子及其受體相互作用的通路被激活，這進(jìn)一步揭示了ONCOTECH作用的潛在分子機(jī)制。
綜合以上實驗結(jié)果，研究人員得出結(jié)論，ONCOTECH通過多種機(jī)制重塑了免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并增強(qiáng)了T細(xì)胞的抗腫瘤功能，從而提高了抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果。
(圖片來自原文)
ONCOTECH如何增強(qiáng)體外抗腫瘤反應(yīng)？
在該研究中，關(guān)鍵的實驗結(jié)果表明ONCOTECH療法通過多種機(jī)制改善免疫抑制性TME，激活免疫應(yīng)答，并增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)：
免疫抑制性TME改善
經(jīng)過T-M@eOA治療的小鼠腫瘤組織中，PD-L1的表達(dá)顯著降低。這一變化表明ONCOTECH療法有助于緩解腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。
ICD效應(yīng)增強(qiáng)
治療后的腫瘤細(xì)胞顯示出更高的鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、熱休克蛋白70（HSP70）、ATP和HMGB1的表達(dá)水平，這些都是免疫細(xì)胞死亡（ICD）效應(yīng)的關(guān)鍵標(biāo)記物。增強(qiáng)的ICD效應(yīng)有助于激活免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊。
抗原提呈能力提升
T-M@eOA治療不僅增加了成熟樹突細(xì)胞（DC細(xì)胞）的比例，還增強(qiáng)了DC細(xì)胞對SIINFEKL抗原的提呈能力，這對于啟動和維持有效的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。
免疫細(xì)胞數(shù)量增加
治療后，小鼠腫瘤組織中的M1樣巨噬細(xì)胞和內(nèi)源性CD8+ T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的數(shù)量減少。這種變化有助于創(chuàng)建一個更有利于免疫介導(dǎo)的腫瘤殺傷的環(huán)境。
免疫應(yīng)答激活
通過對T-M@eOA處理后的腫瘤組織進(jìn)行基因集富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)多種與免疫相關(guān)的通路被激活，包括病毒蛋白與細(xì)胞因子受體相互作用等關(guān)鍵通路。
(圖片來自原文)
ONCOTECH治療小鼠實體瘤效果如何？
在一系列深入的實驗研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了ONCOTECH療法在治療實體瘤方面的顯著效果。以下是關(guān)鍵的實驗結(jié)果：
小鼠黑色素瘤模型
在小鼠皮下B16OVA腫瘤模型中，T-M@eOA治療顯著抑制了腫瘤的生長，并且明顯延長了小鼠的生存期。
轉(zhuǎn)移性腫瘤模型
針對B16OVA轉(zhuǎn)移性腫瘤模型，T-M@eOA治療不僅顯著抑制了腫瘤的生長，還明顯減少了肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，并提高了小鼠的生存期。
自發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤模型
在4T1-OVA自發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤模型中，T-M@eOA治療同樣有效地抑制了腫瘤的生長，減少了肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，并提高了生存期。
人源化PDX模型
在更為臨床相關(guān)的人源化患者衍生腫瘤（PDX）模型中，T-M@eOA治療顯著抑制了腫瘤的生長，并且延長了生存期。
患者來源腫瘤細(xì)胞
實驗還表明，eOA能夠成功地裝載到患者來源的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL細(xì)胞）上，并顯著殺死腫瘤細(xì)胞。
綜合這些實驗結(jié)果，研究團(tuán)隊得出結(jié)論：ONCOTECH療法有效抑制實體瘤的生長，并顯著提高生存期，為實體瘤的治療提供了新的策略和希望。
(圖片來自原文)
該方法在人源化模型中的表現(xiàn)如何？
在該研究中，研究人員首先將患者來源的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）腫瘤組織接種到人源化NSG小鼠體內(nèi)，成功構(gòu)建了模擬人體腫瘤生物學(xué)特性和微環(huán)境的人源化PDX模型。接下來，科學(xué)人員使用攜帶前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）的293T細(xì)胞感染工程化腺病毒（eOA），制備出含有eOA的病毒微囊（MV@eOA）。研究人員利用PSCA特異性CAR-T細(xì)胞與MV@eOA中的PSCA相互作用，實現(xiàn)了MV@eOA與CAR-T細(xì)胞的物理連接，從而形成了CAR-T-MV@eOA嵌合體。
將制備好的CAR-T-MV@eOA嵌合體通過靜脈注射到人源化PDX小鼠體內(nèi)，觀察其對腫瘤生長、生存期、PD-L1表達(dá)以及免疫細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)的影響，以評估其抗腫瘤作用。為了評估CAR-T-MV@eOA治療的長期效果，研究人員對人源化PDX小鼠進(jìn)行了造血干細(xì)胞（HSC）重建，并重復(fù)以上治療過程。
通過這一系列精心設(shè)計的實驗，研究人員證實了CAR-T-MV@eOA嵌合體在人源化PDX模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。
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綜上所述，ONCOTECH作為一種結(jié)合病毒治療和細(xì)胞治療的技術(shù)，展現(xiàn)了良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力。
翌圣助力產(chǎn)品
在該研究中，研究團(tuán)隊使用了翌圣生物染料法熒光定量qPCR試劑進(jìn)行病毒拷貝數(shù)分析及基因表達(dá)分析：
(圖片來自原文)
目前翌圣qPCR mix系列的產(chǎn)品已經(jīng)榮登Nature、 Cell等多個頂級期刊，獲得科研大牛們認(rèn)可！以下僅展示部分助力發(fā)表的高分文章：
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[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
[11] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021;39(12):1581-1588. doi:10.1038/s41587-021-00982-9.(IF=68.164)
[12] Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regulates blood cholesterol levels in humans and mice. Cell Res. 2020;30(4):363-365. doi:10.1038/s41422-020-0303-z.(IF=46.297)
[13] Wang Z, Lu Z, Lin S, et al. Leucine-tRNA-synthase-2-expressing B cells contribute to colorectal cancer immunoevasion. Immunity. 2022;55(6):1067-1081.e8. doi:10.1016/j.immuni.2022.04.017.(IF=43.474)
[14] Bi Q, Wang C, Cheng G, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022;55(8):1466-1482.e9. doi:10.1016/j.immuni.2022.06.018.(IF=43.474)
[15] Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile Temperature Critically Controls the Differentiation and Pathogenicity of T Helper 17 Cells. Immunity. 2020;52(2):328-341.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.006.(IF=43.474)
[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
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