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HCP概念和檢測的必要性
生物制品通常是通過重組技術(shù)經(jīng)由宿主細胞（如細菌、酵母、哺乳動物、昆蟲或植物細胞）進行生產(chǎn)的，產(chǎn)品類型包括單克隆抗體、重組蛋白和疫苗等。這些產(chǎn)品的制造和純化過程不可避免的會引入宿主細胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）雜質(zhì)，既包括宿主細胞的結(jié)構(gòu)蛋白也包括宿主細胞分泌的促生長因子等，是具有多種生理化學(xué)和免疫學(xué)特性的復(fù)雜混合物。盡管使用先進的純化技術(shù)，但一些宿主細胞蛋白仍將作為工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留在中間藥物產(chǎn)品中。
這些雜質(zhì)有潛在的免疫原性，也可能作為佐劑增強生物藥物的產(chǎn)品的免疫反應(yīng)，還會影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和功效，從而引發(fā)人體安全性風(fēng)險，因此，對于HCP的去除水平需要建立合適的監(jiān)測策略，并控制終產(chǎn)品中HCP的含量以符合藥物質(zhì)量的要求。
HCP法規(guī)監(jiān)管要求
生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。對HCP的接受程度將根據(jù)具體情況進行評估，并取決于多個因素，其中包括：劑量、給藥頻率、藥物類型和疾病嚴重程度。
《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。
美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%）。
歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。
國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過驗證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCP，其殘留量通常要求小于100ppm。
由此可見，監(jiān)管機構(gòu)對于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工藝開發(fā)必須經(jīng)過HCP檢測，并證明純化工藝能夠?qū)CP降低到安全水平，并且在最終產(chǎn)品的殘留量限值中，中美的推薦限度值均在0.01%以下。
HCP檢測方法
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。
美國藥典USP<1132>章節(jié)中也提到可采用電泳法、ELISA和LC-MS/MS等方法檢測HCP含量，且由于ELISA法操作簡便、快速、高靈敏、高通量等特點，而被推薦為HCP檢測的方法。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
用途：
檢測HCP中蛋白的總量，可用于產(chǎn)品開發(fā)和過程控制，目前是檢測HCPs的常用方法。
優(yōu)勢：
高靈敏度和特異性；
高通量及可實現(xiàn)自動化；
定量性；
操作簡便、快速。
劣勢：
需要特異性抗體；
無法特異鑒別和評估單個HCP；
方法開發(fā)較為復(fù)雜，抗原需要特殊制備；
方法的影響因素較多，HCPs覆蓋率需評估；
無法鑒定出種類。
免疫印跡(Western Blotting)
用途：
用于大量樣品的一致性篩選，以及檢測與抗HCPs抗體反應(yīng)的未知蛋白。適用于檢測HCPs,并提供HCPs相對分子質(zhì)量的大概信息。
優(yōu)勢：
特異性；
結(jié)果直觀可視化：通過蛋白質(zhì)大小和表達水平的差異進行可視化；
可檢定和定量特定的HCP。
劣勢：
半定量性；
僅限于特定蛋白：只能檢測到與抗體結(jié)合的HCP；
對復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物不夠敏感；
蛋白質(zhì)SDS變性可能導(dǎo)致構(gòu)象表位的丟失；
靈敏度需依賴多克隆抗體質(zhì)量。
二維凝膠電泳法(2-DE)
用途：
常用于上游或下游工藝開發(fā)和表征，其可在單一凝膠上分辨不同HCPs。
優(yōu)勢：
不需要免疫印跡，避免了轉(zhuǎn)膜的問題；
可以實現(xiàn)痕量HCPs雜質(zhì)與產(chǎn)品的分離；
提供大概相對分子質(zhì)量和等電點信息。
劣勢：
過量的蛋白可能會掩蓋HCPs斑點；
可觀察到樣品中HCP的分布，但無法量化。
質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry)
用途：
鑒定單個HCP，提供準(zhǔn)確的宿主細胞蛋白鑒定和定量信息
優(yōu)勢：
高分辨率和準(zhǔn)確性；
鑒定及監(jiān)控各個HCP；
提供HCP的全面譜圖；
能夠覆蓋廣泛的蛋白質(zhì)；
可鑒定出HCP種類。
劣勢：
設(shè)備和技術(shù)要求高；
操作較為復(fù)雜；
成本較高；
方法通量低；
較為復(fù)雜的樣品前處理；
潛在的基質(zhì)影響；
需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析能力。
ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCP的方法，可以測定HCP的總量，但其存在局限性，無法鑒別HCP的種類及豐度，需要其他方法與之互相補充。每種檢測方法都各有其優(yōu)缺點，在實際應(yīng)用中，可以根據(jù)實驗?zāi)康摹悠诽匦?、?zhǔn)確性和操作便捷性等方面進行選擇，結(jié)合使用不同的方法來獲得更全面和準(zhǔn)確的結(jié)果。
此外，美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCP的檢測，并將HCP檢測方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺化方法。
USP<1132>提到在沒有平臺化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結(jié)合細胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺化方法或針對上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。
圖1.USP <1132>中產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議
方法 | 通用商品化試劑盒 | 項目專屬性檢測方法 | 平臺化檢測方法 |
可用性 | 即時可用 | 需要制備抗原，包括克隆空載體細胞系 | 需要使用裸細胞系或空載體細胞系制備抗原 |
開發(fā) | 無需太多準(zhǔn)備工作 | 包括抗原表征、免疫和確認在內(nèi)的檢測開發(fā)至少需要6個月時間 | 包括抗原表征、免疫和確認在內(nèi)的檢測開發(fā)至少需9個月時間 |
多樣性 | 僅限于最常見的表達系統(tǒng) | 各類型表達系統(tǒng)均可用 | 各類型表達系統(tǒng)均可用 |
特異性 | 特異性可能不佳，很可能有未檢測到的HCP | 特異性通常有所增強，抗體覆蓋率更能針對特定的HCP模式 | 與商業(yè)檢測方法相比，特異性有所提高，對檢測性能的理解有所增強，對HCP種類的覆蓋率也有所提高 |
費用 | 初期價格相對便宜，但對整個下游純化過程而言，開發(fā)成本將迅速上升 | 初期成本較高，但收支平衡點通常是在100套試劑盒的價值 | 由于可用于多種產(chǎn)品，具有顯著的成本優(yōu)勢 |
依賴性 | 依賴于某個供應(yīng)商，試劑和控制方案屬于“黑箱”狀態(tài)。 | 能對所有試劑和緩沖液取得全面控制，可以隨時進行調(diào)整 | 對所有試劑具有完整的所有權(quán)和控制權(quán)，可降低供應(yīng)鏈和批次可比性的風(fēng)險 |
監(jiān)管需求 | 不適合用于支持上市許可申請 | 適用于支持許可產(chǎn)品從早期開發(fā)到最終產(chǎn)品上市的整個過程 | 適用于支持早期開發(fā)直至上市許可的整個過程 |
表2.不同HCP試劑盒類型的比較
翌圣生物通用商品化HCP試劑盒
ELISA法是一種使用簡單、靈敏度高且客觀的HCP檢測方法。翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了多款能夠檢測使用了宿主細胞進行轉(zhuǎn)染以及蛋白表達的各生物制品下游純化過程樣品以及終產(chǎn)品中宿主蛋白殘留量的試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。
宿主細胞殘留蛋白檢測 | 貨號與 |
E.coli HCP ELISA檢測試劑盒 | 36712ES |
E.coli HCP ELISA 檢測試劑盒（質(zhì)粒） | 36721ES |
HEK293 HCP ELISA檢測試劑盒 | 36713ES |
CHO HCP ELISA檢測試劑盒 | 36714ES |
翌圣生物定制化HCP試劑盒開發(fā)服務(wù)
鑒于HCP檢測的重要性，翌圣生物以高性能單克隆抗體研發(fā)平臺為依托，建立了蛋白抗體關(guān)鍵原料研發(fā)平臺和獨立的免疫檢測產(chǎn)品開發(fā)實驗室，并配備了先進研發(fā)儀器設(shè)備，如：酶標(biāo)儀和2D-WB雙向凝膠電泳-免疫印跡儀等。研發(fā)平臺已經(jīng)非常成熟，可以快速完成哺乳動物細胞、昆蟲細胞（如Sf9）、細菌和酵母等多種宿主細胞殘留蛋白（HCP）試劑盒定制服務(wù)。
宿主細胞殘留蛋白檢測試劑盒定制服務(wù)，周期6~10個月。
抗原抗體制備：確定HCP抗原、建立HCP參考品、制定免疫路徑和策略、制備HCP抗體等，周期通常4~6個月；
試劑盒開發(fā)：抗體優(yōu)化、覆蓋率分析、試劑盒方法驗證等，周期通常2~4個月。
翌圣生物HCP抗體覆蓋率驗證服務(wù)
已知，ELISA法是行業(yè)內(nèi)檢測HCP殘留的金標(biāo)準(zhǔn)，然而該方法的準(zhǔn)確性取決于多克隆抗體對HCP的覆蓋率。《美國藥典》和《歐洲藥典》中提到免疫親和純化、2D-WB是表征HCP ELISA抗體及其覆蓋率的推薦方法。
2D-WB首先采用二維凝膠根據(jù)大小和電荷分離蛋白質(zhì)，然后將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上與 HCP 抗體一起孵育以進行蛋白質(zhì)印跡檢測。
翌圣生物擁有全套2D-WB儀器設(shè)備和豐富的實驗室操作經(jīng)驗，可針對CHO、E.coli、HEK293等宿主細胞的HCP樣品，提供抗體覆蓋率驗證服務(wù)。
參考文獻：
[1]USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.
[2]USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.
[3]EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.
[4]2020版《中國藥典》3412大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法、3413假單胞菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法、3414酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法。
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