今天想給大家介紹另一種分泌型細(xì)胞因子的檢測(cè)方法，也就是ELISPOT技術(shù)，它是目前用于細(xì)胞因子檢測(cè)靈敏的實(shí)驗(yàn)方法。

01

Enzyme-linked Immunospot Assay，即ELISPOT，全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)。該技術(shù)同時(shí)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況（ELISPOT實(shí)際上是雙夾心ELISA的延伸和發(fā)展，可以看作單細(xì)胞水平的ELISA）。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：①靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)；②單細(xì)胞水平評(píng)價(jià)活細(xì)胞功能；③操作簡(jiǎn)單，可進(jìn)行高通量篩選。

ELISPOT常見的應(yīng)用領(lǐng)域包括：T/B細(xì)胞功能研究、自身免疫檢測(cè)、yizhi、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)、腫瘤研究、傳染病的研究和檢測(cè)、病毒研究等。ELISPOT技術(shù)最初用于B淋巴細(xì)胞分泌抗體的檢測(cè)。由于B細(xì)胞分泌的抗體量一般較大，容易檢測(cè)，即使早期ELISPOT檢測(cè)靈敏度不高，但是用于抗體檢測(cè)還是綽綽有余。后面隨著技術(shù)的進(jìn)步，ELISPOT檢測(cè)的靈敏度越來(lái)越高，因此被更多地用于痕量細(xì)胞因子的檢測(cè)。ELISPOT用于T細(xì)胞功能評(píng)價(jià)時(shí)，能夠區(qū)分活化的T細(xì)胞亞群，例如，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α，Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等。目前利用ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞分泌IFN-γ的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用，尤其在疫苗有效性評(píng)價(jià)中具有重要意義，原因：① IFN-γ與CD8 T細(xì)胞的溶細(xì)胞活性密切相關(guān)；② CD4 T細(xì)胞參與的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生IFN-γ。

02

ELISPOT實(shí)驗(yàn)原理

ELISPOT實(shí)驗(yàn)原理如圖1：

a：ELISPOT 實(shí)驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行，使用 PVDF 膜作為基質(zhì)，膜上包被特異性的單克隆抗體（抗體須無(wú)毒，不含內(nèi)毒素，親和力高），以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。

b：待測(cè)細(xì)胞和刺激物（抗原或絲裂原）在板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，此時(shí)待測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠被包被在膜上的抗體特異性地捕獲。

c：去除細(xì)胞后，加入生物素標(biāo)記的二抗，可與被捕獲的細(xì)胞因子相結(jié)合。

d：然后加入酶標(biāo)親和素與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色反應(yīng)，此時(shí)可以在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形斑點(diǎn)e，一個(gè)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。

e：特異性抗原再刺激引流淋巴結(jié)細(xì)胞9天進(jìn)行小鼠IFN-γ ELISPOT檢測(cè)結(jié)果。

陽(yáng)性細(xì)胞率%=膜斑點(diǎn)數(shù)/加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%

圖1 ELISPOT技術(shù)檢測(cè)原理[1]

注：也可以直接使用熒光素標(biāo)記二抗與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，此時(shí)不再需要進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，可以一次檢測(cè)多種細(xì)胞因子。但是作為膜板材質(zhì)的NC膜和PVDF膜具有自發(fā)熒光的問題，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果背景升高。

實(shí)驗(yàn)所使用的的配對(duì)抗體對(duì)于斑點(diǎn)形成的靈敏度具有重要影響，以下兩圖列出了小鼠和人進(jìn)行細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中推薦使用的配對(duì)抗體?？贵w可以從多種商業(yè)途徑獲得，包括eBiosciences、Biolegend、BD Biosciences和Thermo Scientific等。

圖2 小鼠細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)推薦使用的配對(duì)抗體[1]

圖3 人細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)推薦使用的配對(duì)抗體[1]

以下過(guò)程1（抗原包被）和2（細(xì)胞培養(yǎng)）必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，過(guò)程3（細(xì)胞因子檢測(cè)）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌特異性抗體的B細(xì)胞，該過(guò)程的原理和步驟與細(xì)胞因子ELISPOT測(cè)定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。

（1）準(zhǔn)備無(wú)菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細(xì)的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強(qiáng)其蛋白結(jié)合能力（潤(rùn)濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。

（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇?xì)埩簟?/span>

注：本實(shí)驗(yàn)所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進(jìn)行移液操作時(shí)，移液槍應(yīng)沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對(duì)著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導(dǎo)致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時(shí)，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動(dòng)的水進(jìn)行沖洗。

（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無(wú)菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過(guò)夜。

注：內(nèi)毒素對(duì)ELISPOT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素的來(lái)源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點(diǎn)的形成，使用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻(xiàn)[1]在培養(yǎng)小鼠細(xì)胞時(shí)使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。

以下過(guò)程1（抗原包被）和2（細(xì)胞培養(yǎng)）必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，過(guò)程3（細(xì)胞因子檢測(cè)）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌特異性抗體的B細(xì)胞，該過(guò)程的原理和步驟與細(xì)胞因子ELISPOT測(cè)定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。

（1）準(zhǔn)備無(wú)菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細(xì)的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強(qiáng)其蛋白結(jié)合能力（潤(rùn)濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。

（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇?xì)埩簟?/span>

注：本實(shí)驗(yàn)所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進(jìn)行移液操作時(shí)，移液槍應(yīng)沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對(duì)著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導(dǎo)致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時(shí)，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動(dòng)的水進(jìn)行沖洗。

（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無(wú)菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過(guò)夜。

注：內(nèi)毒素對(duì)ELISPOT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素的來(lái)源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點(diǎn)的形成，使用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻(xiàn)[1]在培養(yǎng)小鼠細(xì)胞時(shí)使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。

圖4 ELISPOT實(shí)驗(yàn)過(guò)程總覽[2]

（3）棄去封閉液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌1次，輕輕在無(wú)菌吸水紙上扣干。（膜板不用時(shí)可在4℃保存數(shù)周）

注：后續(xù)若是使用的是過(guò)往封閉的膜板，每孔可以加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基于室溫下靜置10 min。棄培養(yǎng)基后，重復(fù)該操作一次，再棄培養(yǎng)基，扣干后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

（4）組別設(shè)計(jì)：① 陰性對(duì)照孔：100 μL培養(yǎng)基+100 μL細(xì)胞；② 細(xì)胞樣品孔：100 μL培養(yǎng)基稀釋的適宜濃度刺激物+100 μL細(xì)胞；③ 陽(yáng)性對(duì)照：100 μL陽(yáng)性對(duì)照刺激物+100 μL細(xì)胞（常用陽(yáng)性對(duì)照刺激物類型及濃度見文末附1和2）；④背景對(duì)照孔：不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑。

注1：細(xì)胞加入之后，不宜再震動(dòng)或拍擊ELISPOT板，震動(dòng)或拍擊反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞成圈分布在孔的外周。同時(shí)ELISPOT板之間不能疊放，疊放會(huì)引起整塊板溫度不均勻，導(dǎo)致四周溫度較高的邊緣效應(yīng)。

注2：細(xì)胞狀態(tài)對(duì)ELISPOT檢測(cè)結(jié)果具有重要意義。細(xì)胞狀態(tài)好、活力高、功能保持完整，那么檢測(cè)獲得的結(jié)果必然好。因此在進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)時(shí)要盡可能保證細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于新鮮分離的原代細(xì)胞，需要盡可能減少分離過(guò)程中的機(jī)械損傷以及有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害。對(duì)于凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞，通常較難保證細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，因此對(duì)細(xì)胞凍存過(guò)程提出了更嚴(yán)格的要求。

（1）棄去孔內(nèi)的混合培養(yǎng)液，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，在冰浴上孵育10 min。孵育結(jié)束后，每孔用200 μL PBST（含0.05%Tween的PBS溶液）溶液洗滌5次，以除去細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞因子。最后一次棄去液體后，輕輕在吸水紙上扣干。

（3）孵育結(jié)束后，每孔以200 μL PBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時(shí)，將PVDF膜板背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，輕輕在吸水紙上扣干。

（5）酶底物顯色：每孔加入200 μLPBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時(shí)，將PVDF膜板背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，輕輕在吸水紙上扣干。隨后每孔加入100 μL BCIP/ NBT（用于ALP）或100 μL AEC（用于HRP）顯色液，用鋁箔覆蓋膜板避光。

（6）待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到合適大小，以去離子水洗滌2次，終止顯色反應(yīng)。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30 min，讓膜自然晾干。

（7）將ELISPOT板置于自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)后，進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)并作統(tǒng)計(jì)分析[3]。

注：斑點(diǎn)計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)注意區(qū)分由纖維、膜撕裂、碎片等導(dǎo)致的不規(guī)則斑點(diǎn)，一般細(xì)胞生成的斑點(diǎn)通常為圓形。

附1：實(shí)驗(yàn)所用的刺激物（抗原）類型[4]：

① Freeze and Thaw lysate（細(xì)胞凍融產(chǎn)物）

② Class I and Ⅱ Peptides（I類和Ⅱ類肽）

③ Recombinant proteins（重組蛋白）

④ RNA

圖注：來(lái)自免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ+斑點(diǎn)形成細(xì)胞。C57BL/6小鼠在第0天和第21天單獨(dú)用OVA（10 μg）或聯(lián)合明礬（40 μg）+ CpG 1826（10 μg）佐劑進(jìn)行肌肉注射誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在第28天收集脾細(xì)胞，用IFN-γ ELISpot分析OVA特異性CD4 T細(xì)胞。代表性結(jié)果如圖a-d。a, b：經(jīng)OVA免疫后分離的小鼠細(xì)胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR（CD4 Epitope）進(jìn)行刺激。c, d：經(jīng)OVA+明礬/CpG聯(lián)合免疫后分離的小鼠細(xì)胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR進(jìn)行刺激。

04

ELISPOT評(píng)價(jià)T細(xì)胞功能注意事項(xiàng)

在前面的實(shí)驗(yàn)步驟中，我已經(jīng)盡可能羅列了各步操作中應(yīng)當(dāng)注意的事項(xiàng)，在此根據(jù)文獻(xiàn)[5]對(duì)相關(guān)內(nèi)容再做補(bǔ)充，希望幫助大家拿下這個(gè)實(shí)驗(yàn)。

（7）每孔細(xì)胞數(shù)：如果抗原特異性T細(xì)胞頻率未知，推薦以3-5×10⁵細(xì)胞/孔作為起始數(shù)目。在1-8×10⁵細(xì)胞/孔的范圍內(nèi)，加入的細(xì)胞數(shù)與形成的斑點(diǎn)數(shù)具有良好的線性關(guān)系，實(shí)際可根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。此外，由于臨床樣本的珍貴性，PBMC以10⁵細(xì)胞/孔設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，可以幫助獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果。

注：如有必要，可通過(guò)滴定來(lái)確定ELISPOT實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞密度，以獲得特定組織類型來(lái)源細(xì)胞的最佳斑點(diǎn)分離效果。文獻(xiàn)[1]給出了一些常見細(xì)胞的推薦使用濃度。在使用純化的T淋巴細(xì)胞或者每孔細(xì)胞數(shù)少于10⁶時(shí)，推薦在活化期間加入額外的飼養(yǎng)層細(xì)胞（比如脾細(xì)胞）或抗原提呈細(xì)胞（APC），前提是確保加入這些細(xì)胞有效。特定組織每孔細(xì)胞常用濃度為：

⑨人APCs：自體PBMCs 0.5×10⁶細(xì)胞/孔

（9）DMSO濃度控制：大多數(shù)I類MHC限制性肽是疏水性的，需要用DMSO助溶，超過(guò)0.5%濃度的DMSO對(duì)淋巴細(xì)胞，尤其是活化的淋巴細(xì)胞有毒。