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近年來，隨著生物醫(yī)藥迅猛發(fā)展以及基因細胞治療領(lǐng)域研究的深入，如何把控生物制品安全可靠，成為各國法規(guī)政府重視以及監(jiān)管的要點。因為支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，所以對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“都必須確保無支原體污染”。
監(jiān)管機構(gòu)要求的支原體檢測點
2020版中國藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對于生產(chǎn)用細胞，需要對主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產(chǎn)終末細胞（EOPC）進行支原體檢查；
《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）》中建議在關(guān)鍵時間點對適合的中間樣品開展支原體等安全性相關(guān)檢測或采取相關(guān)的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產(chǎn)品的放行檢項；
FDA，Guidance for Industry :Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。
快檢法和傳統(tǒng)方法的比較
在快速檢測方法（NAT，核酸擴增技術(shù)）出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和指示細胞法因其檢測周期長或靈敏度問題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長或者需要基于風險評估對細胞原料進行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對支原體檢測時效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。
目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測方法，但需要對該方法進行驗證以及與傳統(tǒng)方法進行對比其檢測靈敏度不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。2020版中國藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測方法，但其中也提到了“也可采用經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認可的其他方法”。2022年5月，國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）》中提到“當檢驗樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足，可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進行放行檢測，但是新型檢測方法應(yīng)經(jīng)過充分驗證”。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測的方法，被越來越多的原材料供應(yīng)商、以及ATMP企業(yè)所使用。
快檢法(NAT)-方法驗證要求
對于如何進行NAT方法的驗證，目前歐洲藥典<2.6.7>和日本藥典里都詳細介紹，其內(nèi)容基本一致。中檢院也發(fā)表了文章《支原體檢查的核酸檢測方法及方法學驗證的思考》，以期對我國支原體核酸擴增法檢測的研發(fā)者及使用者提供借鑒。支原體NAT法須進行專屬性（Specificity）、檢測限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）驗證。如果使用商業(yè)化試劑盒進行支原體檢測，則可以基于供應(yīng)商的完整試劑盒性能驗證報告再結(jié)合本身實驗室環(huán)境和樣品類型進行合適的方法適用性驗證。
專屬性（Specificity）
專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。EP中提到需要在驗證中關(guān)注與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較近的其他細菌種屬之間的交叉反應(yīng)，如革蘭氏陽性菌包括梭菌屬Clostridium、乳桿菌屬Lactobacillus和鏈球菌屬Streptococcus。當然也需要關(guān)注宿主細胞和實驗操作環(huán)境中比較常見的如人源DNA污染類型。
檢測限（Detection Limit）
檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據(jù)，不需要被準確定量為一個準確值。EP中要求每種支原體每個稀釋濃度都需要有24次檢測數(shù)據(jù)，可以在不同天做3次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度做8次重復檢測；或者可以選擇不同天做4次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度做6次重復檢測。檢測陽性率需要滿足95%以上可以作為檢測限。
對需要進行檢測限確認的支原體類型，試劑盒廠家需盡可能多的覆蓋法規(guī)藥典中要求的支原體類型，并需要對每種支原體的檢測限進行摸索。而對于生物制品企業(yè)來說，通常需要根據(jù)實際使用的原輔料來源進行選擇。另外建議把人源支原體類型考慮進去。
耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。對于耐用性的評估，需要關(guān)注支原體檢測方法對于檢測試劑中MgCl2、引物和dNTP的濃度變化，核酸提取試劑盒或提取步驟的改變以及使用不同核酸擴增儀的耐受程度。
翌圣生物商業(yè)化支原體快檢試劑盒(NAT，qPCR法)
MycAway™支原體qPCR檢測試劑盒(探針法)是基于NAT的一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品。該試劑盒基于定量PCR技術(shù)，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋160多種支原體DNA序列；并且嚴格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關(guān)指南和要求進行驗證，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。
它能夠與MolPure® 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，可以通過手動提取或者使用Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀自動提取樣本核酸。樣本經(jīng)過前處理去除干擾雜質(zhì)獲得純化的支原體DNA后，通過qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結(jié)果進行判定。
翌圣生物支原體qPCR檢測服務(wù)（樣品適用性驗證）
根據(jù)EP 2.6.7和JP XVII G3中的要求，用戶在使用商業(yè)化試劑盒進行支原體檢測時，除了可以使用試劑盒供應(yīng)商提供的試劑盒性能驗證數(shù)據(jù)之外，還需要根據(jù)本身實驗環(huán)境和條件并針對自己的樣品，進行支原體檢測方法的方法適用性驗證。驗證參數(shù)包括：檢測限、專屬性、耐用性以及對比實驗。
翌圣生物針對質(zhì)控類檢測試劑建立了相應(yīng)的研發(fā)和生產(chǎn)平臺。其中，研發(fā)平臺以雙向分子酶設(shè)計與定向進化平臺和蛋白高密度發(fā)酵與超潔凈純化平臺為依托，建立分子診斷試劑關(guān)鍵原料研發(fā)平臺和獨立的分子和免疫檢測產(chǎn)品開發(fā)實驗室，并配備了先進的研發(fā)儀器設(shè)備。生產(chǎn)平臺，嚴格按照ISO13485質(zhì)量體系標準建設(shè)和管理，擁有獨立的潔凈生產(chǎn)車間，滿足不同產(chǎn)品定量和定性的要求。層層把關(guān)，每一步的放行，都經(jīng)過多項嚴格而高標準的質(zhì)量驗收。
基于上述研發(fā)和生產(chǎn)平臺，翌圣生物可針對生物制品研發(fā)和生產(chǎn)過程中的樣本，提供配套翌圣生物“支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）”(貨號：40618ES)的方法適用性驗證服務(wù)。
（最終解釋權(quán)歸翌圣生物所有）
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