在探索生命科學(xué)的奧秘中，紫杉醇這一神奇的藥物始終占據(jù)著舉足輕重的地位。作為一種抗擊癌癥的利器，紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它由一個高度活躍的碳骨架和一條帶有苯基異亮氨酸的側(cè)鏈構(gòu)成。然而，正是這種構(gòu)造，使得紫杉醇的合成之路充滿了挑戰(zhàn)。

研究人員對紫杉醇的生物合成路徑進行了長達半個世紀的研究，但仍有許多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化步驟隱藏在迷霧之中。特別是，氧化四環(huán)烷環(huán)的形成和C9位碳原子的氧化過程，至今仍是一個未解之謎，它們像兩座高峰，阻擋在我們理解紫杉醇合成路徑的道路上。

在這條合成路徑中，找到負責(zé)氧化四環(huán)烷環(huán)和C9位氧化的關(guān)鍵酶，就像是找到了一把鑰匙，能夠?qū)⒆仙即忌锖铣傻母鱾€孤立環(huán)節(jié)串聯(lián)起來，形成一條完整的鏈條。

隨著紫杉醇在癌癥治療中的應(yīng)用越來越廣泛，市場對它的需求也在不斷攀升。然而，目前依賴天然資源提取的半合成生產(chǎn)方法，已經(jīng)無法滿足這種日益增長的需求。這就像一條狹窄的通道，無法承載日益增多的行人。

幸運的是，合成生物學(xué)的興起為我們提供了一條新的道路。通過合成生物學(xué)，我們有望實現(xiàn)紫杉醇的綠色、可持續(xù)生產(chǎn)。因此，揭開紫杉醇生物合成路徑的神秘面紗，不僅能夠滿足市場需求，更能夠推動合成生物學(xué)的發(fā)展，開啟一個全新的綠色制藥時代。

在探索紫杉醇這一神奇藥物的背后，研究人員采取了一系列精妙的實驗步驟，揭示了TOT1基因在氧化環(huán)形成中的關(guān)鍵角色。首先，他們運用了一種巧妙的篩選策略。基于紫杉烷生物合成途徑的知識，研究人員將CYP725A家族的基因分為三個小組，并在煙草葉片中同時表達了這三組基因。隨后，他們使用液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)來檢測底物的氧化產(chǎn)物。

接著，他們進行了活性篩選。在表達了第二組基因的葉片中，研究人員觀察到了明顯的底物氧化產(chǎn)物峰，這表明該組基因中可能含有他們尋找的酶。

為了驗證這一假設(shè)，研究人員單獨表達了第二組中的每一個基因。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Chr9_74725878基因被表達時，底物氧化產(chǎn)物的數(shù)量顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)證明了該基因編碼的蛋白質(zhì)具有催化氧化環(huán)形成的能力。

基于這一發(fā)現(xiàn)，該基因被命名為TOT1，并通過體外表達和底物喂養(yǎng)實驗進一步驗證了其功能。

為了深入了解TOT1的作用機理，研究人員運用了結(jié)構(gòu)模擬和反應(yīng)機理計算的方法。他們的研究揭示了TOT1介導(dǎo)的氧化環(huán)形成反應(yīng)機理，即它能直接將烯基轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和氧化環(huán)。

最后，為了驗證TOT1在紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵作用，研究人員在紫杉植物中敲低了TOT1的表達。他們觀察到，百菌素和紫杉醇的含量隨之降低，這一結(jié)果進一步證明了TOT1在紫杉醇生物合成中的重要性。

（圖片來自原文）

TOT1是一種具有雙重功效的氧化酶。能夠?qū)⒆仙即贾械南┗苯愚D(zhuǎn)化為環(huán)氧化物，進而形成氧化烷基環(huán)。這一過程無需經(jīng)過環(huán)氧化物作為中間體的傳統(tǒng)路徑，而是通過一種更為直接和高效的轉(zhuǎn)化方式。

在TOT1的催化下，烯基首先經(jīng)歷氧化反應(yīng)，形成環(huán)氧化物。然而，這個環(huán)氧化物并非故事的終點，而是通過一系列結(jié)構(gòu)重排，最終演變成為氧化烷基環(huán)。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了人們對氧化烷基環(huán)形成機制的傳統(tǒng)認知，為理解紫杉醇的生物合成過程帶來了新的視角。

（圖片來自原文）

通過精確的計算模擬和深入的結(jié)構(gòu)分析，研究人員揭示了TOT1催化氧化烷基環(huán)形成的詳細反應(yīng)機理。他們觀察到了過渡態(tài)和中間體的形成，這些都是在TOT1催化下發(fā)生的微妙變化。

（圖片來自原文）

特別值得注意的是，模擬計算結(jié)果顯示，氧化烷基環(huán)產(chǎn)物的形成在能量上和動力學(xué)上都是優(yōu)先的，這與實驗結(jié)果不謀而合。這一發(fā)現(xiàn)不僅驗證了計算模型的準(zhǔn)確性，也為紫杉醇的生物合成提供了新的科學(xué)依據(jù)。

這一機制的創(chuàng)新之處在于，它打破了我們以往對環(huán)氧化物作為中間體形成氧化烷基環(huán)的認知壁壘，為氧化烷基環(huán)的形成提供了全新的解釋。

研究人員采取了一系列精確的實驗步驟，最終揭示了關(guān)鍵的C9羥基化酶T9αH1。

首先，研究人員對不同組織中的紫衫素含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)紫衫素主要在Taxus植物的根部積累，而在針葉和樹皮中的含量則相對較低。

接著，他們對紫衫素生物合成途徑中已知基因的表達模式進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些基因在根部高度表達，與紫衫素的含量分布密切相關(guān)。

進一步地，研究人員對CYP725A家族基因的組織特異性表達模式進行了分析，并從中篩選出了17個潛在的候選基因。

為了鑒定這些候選基因中是否含有合成紫衫素所需的C9羥基化酶，研究人員在煙草植物中逐一表達了這些候選基因，并同時表達了已知的紫衫素生物合成基因。他們通過檢測是否能夠合成紫衫素來評估這些候選基因的功能。

實驗結(jié)果顯示，只有Chr9_26460669基因的表達使得煙草能夠合成紫衫素。這一發(fā)現(xiàn)證實了Chr9_26460669基因編碼了C9羥基化酶，并被命名為T9αH1。

為了進一步驗證T9αH1的C9羥基化酶活性，研究人員在煙草中表達了T9αH1，并成功檢測到了紫衫素的生成。

通過這一系列精妙的實驗步驟，研究人員不僅成功從候選基因中篩選并鑒定出了C9羥基化酶T9αH1，而且補了巴卡丁III生物合成途徑中的一個關(guān)鍵空白。

（圖片來自原文）

研究人員首先在煙草葉片中同時共表達了已知參與巴卡丁III生物合成的基因，包括TXS、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TAT和TBT。

接著，他們在上述已知基因的基礎(chǔ)上，加入了新發(fā)現(xiàn)的兩個關(guān)鍵基因TOT和T9αH，為巴卡丁III的生物合成途徑增添了新的力量。

隨后，研究人員在煙草葉片提取物中檢測到了一個新產(chǎn)物峰，其質(zhì)譜和保留時間與巴卡丁III一致，這表明他們可能已經(jīng)成功合成巴卡丁III。

為了進一步確認這個新產(chǎn)物的身份，研究人員運用了MS/MS分析技術(shù)，結(jié)果確認該新產(chǎn)物確實是巴卡丁III。

為了鑒定巴卡丁III生物合成的核心途徑，研究人員逐一移除了每個基因，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)所有9個基因同時表達時才能產(chǎn)生巴卡丁III，這證明了這9個基因構(gòu)成了巴卡丁III生物合成的核心途徑。

（圖片來自原文）

此外，他們還發(fā)現(xiàn)TAT不僅可以催化C10位的乙?；襎10βH在C10位氧化反應(yīng)中可以被T5αH等其他酶取代。

特別值得注意的是，盡管DBAT被認為是C10位乙?；年P(guān)鍵酶，但研究人員發(fā)現(xiàn)，即使在沒有DBAT的情況下，巴卡丁III仍然可以合成，這表明TAT可能也具有C10位的乙?；δ堋?/span>

通過人工共表達關(guān)鍵基因，研究人員成功地在煙草中重建了巴卡丁III的生物合成途徑，為進一步通過合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇提供了堅實的基礎(chǔ)。

在探索巴卡丁 III 生物合成過程的奧秘中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列核心基因之間功能協(xié)同性的顯著特征。首先，TOT、T9αH等基因主要在根部表達，與下游基因的表達模式相似，表明這些基因在組織水平上存在協(xié)同表達的現(xiàn)象。

其次，經(jīng)過茉莉酸處理后，這些基因的表達模式呈現(xiàn)協(xié)同上調(diào)的趨勢，與下游基因的表達模式相似，這提示茉莉酸可能參與協(xié)同調(diào)控這些基因。

此外，這些基因的表達之間存在顯著的正相關(guān)性，而與T14βH的表達模式不同，這表明它們之間存在協(xié)同調(diào)控關(guān)系。

在亞細胞水平上，這些酶主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與質(zhì)體和細胞質(zhì)中的酶存在協(xié)同作用，形成協(xié)同代謝途徑。

進一步地，這些基因構(gòu)成的代謝網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀而非線性，形成協(xié)同的代謝途徑。

最后，這些基因在染色體上的分布位置存在關(guān)聯(lián)，暗示它們之間可能存在協(xié)同進化關(guān)系。

綜合來看，這些核心基因在表達模式、調(diào)控、亞細胞定位、代謝途徑等方面存在協(xié)同性，共同參與巴卡丁 III 的生物合成過程。

（圖片來自原文）

綜上所述，本研究確定了紫杉科植物中催化生成抗癌藥物紫杉醇的關(guān)鍵酶。紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含一個功能化的二萜核心骨架(巴卡丁III)和苯異戊烯?；鶄?cè)鏈。盡管在過去五十年中進行了大量的研究，但巴卡丁III的完整生物合成途徑仍不清楚。研究人員通過對紫杉醇生物合成途徑的篩選，發(fā)現(xiàn)了一個雙功能細胞色素P450酶TOT1,它催化了紫杉醇中氧雜環(huán)的形成。通過共表達其他已知的參與巴卡丁 III合成的基因，研究人員成功地在煙草中人工重建了巴卡丁 III的生物合成途徑。這項研究為利用合成生物學(xué)手段綠色高效制造紫杉醇提供了可能。

在該研究中，研究團隊使用了翌圣生物染料法熒光定量qPCR試劑進行基因表達分析：

(圖片來自原文)

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