phi29 DNA聚合酶是一種從Bacillus subtilis噬菌體phi29中克隆出來的嗜溫DNA聚合酶，具有很強(qiáng)的鏈置換活性、持續(xù)合成能力和高的保真度，是滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和多重鏈置換擴(kuò)增（MDA）的用酶。目前，它在DNA酶法合成、全基因組擴(kuò)增、納米孔測序儀開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，應(yīng)用潛力巨大。接下來，小編將從phi29 DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)、活性、應(yīng)用等方面進(jìn)行展開介紹。

Phi29 DNA聚合酶是一種分子量約為66 kda的單體酶，該酶由多個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括核酸外切酶結(jié)構(gòu)域、Thumb結(jié)構(gòu)域、Palm結(jié)構(gòu)域，以及兩個(gè)重要的TPR結(jié)構(gòu)域，具有5'-3'聚合酶活性、3'-5'核酸外切酶活性和鏈置換活性，在生物學(xué)研究及應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖1. phi29 DNA 聚合酶結(jié)構(gòu)[1]

Phi29 DNA 聚合酶有3’-5’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，具備高保真（校正）活性，其保真度是Taq酶的1000倍，高于目前絕大多數(shù)高保真酶的保真度，可保證擴(kuò)增反應(yīng)的高保真性。

phi29 DNA聚合酶的聚合活性源于其Palm、Thumb和Fingers結(jié)構(gòu)域組合，共同構(gòu)建了一個(gè)高效的聚合活性區(qū)域。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了它5'-3'聚合酶活性，使其對(duì)單鏈DNA或單鏈RNA展現(xiàn)出底物親和力和強(qiáng)大的持續(xù)合成能力。在單次聚合反應(yīng)中，phi29 DNA聚合酶能夠?qū)崿F(xiàn)超過70kb的連續(xù)聚合延伸。

phi29 DNA聚合酶的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域——TPR1和TPR2的存在，使得phi29 DNA聚合酶展現(xiàn)出了強(qiáng)大的鏈置換活性，能夠有效地解鏈和復(fù)制DNA的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。因此，在體外環(huán)境下，phi29 DNA聚合酶能夠執(zhí)行不依賴于熱循環(huán)的等溫DNA聚合反應(yīng)，展現(xiàn)出其DNA復(fù)制能力。

相較于常規(guī)DNA聚合酶，phi29 DNA聚合酶展現(xiàn)出了持續(xù)合成能力和鏈置換活性，其保真度也遠(yuǎn)超常規(guī)聚合酶。這些顯著的優(yōu)勢(shì)使得phi29 DNA聚合酶在多種DNA擴(kuò)增技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用，如多重置換擴(kuò)增（MDA）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）等。接下來，我們將詳細(xì)介紹phi29 DNA聚合酶在這些主要技術(shù)中的表現(xiàn)和應(yīng)用前景。

多重置換擴(kuò)增（MDA）的核心原理在于利用隨機(jī)的六聚體引物與phi29 DNA聚合酶在恒溫條件下協(xié)同作用，以實(shí)現(xiàn)DNA的高效擴(kuò)增。這一過程依賴于phi29 DNA聚合酶的持續(xù)合成能力、高保真度及鏈置換活性（實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增的關(guān)鍵）。

在反應(yīng)過程中，六聚體引物隨機(jī)結(jié)合至DNA模板之上，隨后phi29 DNA聚合酶在DNA的多個(gè)位點(diǎn)同步啟動(dòng)復(fù)制過程。新合成的DNA逐步取代模板的互補(bǔ)鏈，而被置換的互補(bǔ)鏈則能夠作為新的模板繼續(xù)參與擴(kuò)增反應(yīng)。MDA憑借其能夠從微量樣本中產(chǎn)出大量高質(zhì)量DNA的能力，已成為當(dāng)前單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。

圖2. MDA原理圖[2]

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）是一種模擬自然界微生物環(huán)狀DNA滾環(huán)復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增方法。該方法以環(huán)狀DNA為模板，借助一個(gè)與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)的短DNA引物，在phi29 DNA聚合酶（具備強(qiáng)持續(xù)合成能力、高保真度及鏈置換活性）的催化作用下沿環(huán)狀模板延伸，并持續(xù)置換先前產(chǎn)生的延伸鏈。最終，這一過程將產(chǎn)生重復(fù)的長單鏈DNA產(chǎn)物。通過在RCA基礎(chǔ)上引入與延伸產(chǎn)物退火雜交的另一條或多條引物，還可以形成超分支RCA，實(shí)現(xiàn)超指數(shù)式擴(kuò)增。RCA技術(shù)以其高靈敏度、良好特異性和易于操作的特性，在SNP檢測、質(zhì)粒體外酶促生產(chǎn)、DNA測序模板制備等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。

圖3. RCA原理圖[3]

A: 以單引物擴(kuò)增產(chǎn)生長鏈DNA；B: 以隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)生長鏈串聯(lián)DNA

質(zhì)粒DNA，作為mRNA疫苗、DNA疫苗以及細(xì)胞基因治療等多個(gè)領(lǐng)域的核心“元件”，扮演至關(guān)重要的角色。傳統(tǒng)的質(zhì)粒生產(chǎn)方式涉及大腸桿菌發(fā)酵和多級(jí)放大擴(kuò)增過程，最終進(jìn)入純化環(huán)節(jié)。然而，發(fā)酵過程中的不可控風(fēng)險(xiǎn)因素限制了高質(zhì)量質(zhì)粒載體的產(chǎn)量，這成為了疫苗產(chǎn)能的關(guān)鍵瓶頸。

英國的Touchlight公司創(chuàng)新性地推出了doggybone DNA（dbDNA）載體技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)了傳統(tǒng)的細(xì)菌發(fā)酵制備質(zhì)粒DNA的方法，使體外酶法合成DNA成為可能。

這種創(chuàng)新方法帶來了以下顯著優(yōu)勢(shì)：

• 速度快，產(chǎn)量高：體外酶促法僅需數(shù)周即可生產(chǎn)克級(jí)dbDNA（常規(guī)質(zhì)粒生產(chǎn)通常是毫克級(jí)），比傳統(tǒng)的細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)質(zhì)粒DNA快5倍。

• 優(yōu)化載體：dbDNA可以編碼更長、更復(fù)雜或更不穩(wěn)定的基因，且無需細(xì)菌DNA和抗性篩選，避免生物發(fā)酵過程的諸多不可控風(fēng)險(xiǎn)。

dbDNA體外酶法合成：

dbDNA是一種小的、線性的雙鏈共價(jià)閉合DNA結(jié)構(gòu)，其形狀類似于“狗骨頭”（doggybone），可以編碼長片段、復(fù)雜或不穩(wěn)定的DNA序列，由3個(gè)部分組成：兩端的TEL序列（TelN端粒酶切割后的互補(bǔ)的閉合結(jié)構(gòu)），及中間的目標(biāo)DNA序列。

圖4. dbDNA結(jié)構(gòu)（來自Touchlight）

dbDNA體外酶法合成工藝：

圖5. dbDNA體外酶法合成工藝（來自Touchlight）

這種體外DNA酶法合成技術(shù)以其優(yōu)勢(shì)，能夠巧妙地規(guī)避生物發(fā)酵過程中存在的多種不可預(yù)測和難以控制的風(fēng)險(xiǎn)。正因如此，它為眾多新興技術(shù)，如mRNA疫苗、DNA疫苗、基因治療以及基因編輯等提供了強(qiáng)有力的支持，并展現(xiàn)出了極為廣闊的應(yīng)用前景。翌圣生物可提供DNA酶法合成的核心酶原料：phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）及TelN端粒酶（Cat#4540ES）等，助力DNA酶法合成技術(shù)研發(fā)生產(chǎn)。

單細(xì)胞測序是研究細(xì)胞間差異的一種重要技術(shù)，但由于單個(gè)細(xì)胞的基因組DNA含量較低（pg級(jí)別），無法滿足各大測序平臺(tái)上機(jī)要求，需要通過全基因組擴(kuò)增技術(shù)（WGA）來解決該問題。其中MDA是目前應(yīng)用廣泛的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)。其操作簡單，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求低，使用非預(yù)變性的模板時(shí)也可取得良好的效果，可進(jìn)一步簡化實(shí)驗(yàn)操作及避免污染的產(chǎn)生，廣泛應(yīng)用于基因組測序、SNPs 分析等相關(guān)領(lǐng)域。

圖6. 單細(xì)胞測序流程圖[4]

第三代測序技術(shù)是指單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，也叫從頭測序技術(shù)，其最大的特點(diǎn)就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測序。目前已應(yīng)用于基因組測序、甲基化研究和突變鑒定等多個(gè)研究領(lǐng)域。英國牛津納米孔公司所開發(fā)的納米孔（Nanopore）測序技術(shù)便是三代測序的代表性技術(shù)之一。

其優(yōu)勢(shì)主要有：

圖7. 納米孔測序原理圖（來自O(shè)xford Nanopore Technologies）

納米孔測序原理：

納米孔測序基于電信號(hào)，核心是利用一個(gè)納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合特定的分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，利用動(dòng)力蛋白牽引核酸穿過納米孔，當(dāng)核酸分子通過納米孔時(shí)，會(huì)引起電荷狀態(tài)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致電阻膜上電流發(fā)生波動(dòng)。納米孔直徑通常比DNA分子直徑小一個(gè)數(shù)量級(jí)，保證只有一個(gè)DNA分子通過每一個(gè)納米孔，ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時(shí)對(duì)電流產(chǎn)生的干擾不同，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測并解碼這些電流信號(hào)便可確定堿基序列，從而實(shí)現(xiàn)測序。

納米孔測序關(guān)鍵元件的關(guān)鍵元件之一是Motor——馬達(dá)蛋白。在文庫構(gòu)建時(shí)，需要在接頭上連接一種馬達(dá)蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。常見的Motor包括DNA聚合酶類的Phi29 DNA聚合酶或其變體、解旋酶類的RecD解旋酶、TraI解旋酶、Dda解旋酶等。

目前國內(nèi)外有多家公司正在布局或已有納米孔測序儀器上市，在儀器開發(fā)中，天然的phi29 DNA聚合酶或解旋酶，往往難以滿足高標(biāo)準(zhǔn)的測序要求。為此，翌圣生物不僅可提供商業(yè)化分子酶產(chǎn)品（如phi29 DNA聚合酶Cat#14404ES等），還針對(duì)在測序儀器開發(fā)等應(yīng)用中可能面臨的市售酶或自然酶性能不足的問題，成立以酶進(jìn)化技術(shù)為驅(qū)動(dòng)、專注于提供酶改造定制化解決方案的子公司-鎂孚泰生物（點(diǎn)擊了解更多）。依托于翌圣生物，鎂孚泰生物現(xiàn)有六大技術(shù)平臺(tái)：ZymeEditor創(chuàng)新酶進(jìn)化平臺(tái)、多宿主高效表達(dá)平臺(tái)、發(fā)酵工藝開發(fā)平臺(tái)、純化工藝開發(fā)平臺(tái)、超潔凈酶生產(chǎn)平臺(tái)以及酶分析與質(zhì)控平臺(tái)?；谶@六大技術(shù)平臺(tái)，鎂孚泰生物可提供酶定向改造、新酶開發(fā)、酶工藝開發(fā)以及GMP級(jí)別規(guī)?；a(chǎn)的全套定制解決方案，以滿足酶在體外診斷、生物醫(yī)藥、合成生物、醫(yī)療美容、醫(yī)藥中間體以及測序等領(lǐng)域的應(yīng)用需求。

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圖9.翌圣及進(jìn)口品牌phi29 DNA聚合酶不同DNA模板投入量擴(kuò)增結(jié)果。C1:無模板對(duì)照，C2：無酶對(duì)照。結(jié)果顯示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）靈敏度及擴(kuò)增產(chǎn)量優(yōu)于進(jìn)口品牌。

圖10. 翌圣phi29 DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)量。模板：293細(xì)胞gDNA，投入100ng；反應(yīng)時(shí)間：16h。結(jié)果顯示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）在100ng模板投入量下，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)到2 μg/μL。

參考文獻(xiàn)

[1] Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, et al. Insights into strand displacement and processivity from the crystal structure of the protein-primed DNA polymerase of bacteriophage phi29. Mol Cell. 2004;16(4):609-618. 

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[3] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

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