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大家是不是都面臨這樣的場景：辛苦處理的細胞，擔心凍存對結(jié)果有影響，熬夜立馬實驗？病房外焦急等待手術樣本，拿到樣本后馬不停蹄奔向?qū)嶒炁_？野外采集的樣本，恨不能將實驗臺搬到田野？
鐺鐺鐺鐺，凍存樣本處理protocol放送了！
（Tips:細胞凍存或者組織凍存時，建議放在液氮中保存，這樣樣本存儲時間更久，得到的結(jié)果更好哦?。?/span>
凍存細胞預處理
1.在開始細胞解凍前，將水浴鍋設置為37℃；
2.準備約50 mL溫熱（37℃預熱）的RPMI-1640 +10% FBS培養(yǎng)基；
3.離心機打開設置4℃，300 g，5 min。
1.從-80℃冰箱或液氮中取出凍存管，并立即于37℃水浴鍋快速晃動解凍，直到凍存管內(nèi)的試劑融化（整個過程在1-2 min內(nèi)完成）。
2.從水浴中取出凍存管，用酒精棉對凍存管口及外表面進行消毒；
3.將細胞樣本連同凍存液一起轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管中，加入5 mL預熱的細胞培養(yǎng)基RPMI-1640 +10% FBS，輕柔吹打?qū)⒁后w混合均勻；
4.室溫300 g，離心5 min，棄上清（擔心細胞被吸到可留5-10 μL的上清）；
5.離心后棄去上清，根據(jù)細胞量加入150 μL預冷的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，取5μL 細胞懸液加入15 μL 的AO/PI染色，細胞計數(shù)及細胞活性；
6.如細胞活率大于80%，有核率大于70%，背景干凈可以直接進行下游實驗。（若細胞活性較低，也可正常提核，但是后續(xù)ATAC實驗結(jié)果可能出現(xiàn)重復率不高的情況，需根據(jù)實驗室自己的項目情況來具體評估）。
ATAC實驗-細胞收集
1.獲細胞并計數(shù)：取實驗所需數(shù)量的細胞(5萬左右)于 1.5 mL EP 管中，4℃ 2,300 rpm (500 × g)離心 5 min，吸凈管內(nèi)溶液。
【注】：對于大小不同的細胞，請根據(jù)實際情況調(diào)整離心力。
2.每個樣本加入 50 μL 預冷的 Wash Buffer 重懸細胞，4℃ 2,300 rpm (500 × g)低速離心 5 min，吸凈管內(nèi)溶液。
3.每個樣本中加入 50 μL Lysis Buffer，輕輕吹打重懸，冰上放置 5 min，4℃，2,300 rpm (500 × g)離心 5 min，去除上清。
4.直接進行后續(xù)的轉(zhuǎn)座反應。
凍存組織預處理
樣本處理
1. 將凍存小鼠肝臟組織從-80℃取出放于培養(yǎng)皿中，用刀片切下綠豆粒大小（約30mg）組織，隨后立即將培養(yǎng)皿放置冰上。
2. 組織大部分融化后，加入1mL預冷的PBS清洗小鼠肝臟組織，用移液器吸去PBS，共清洗3次。
3. 清洗完成的肝臟組織可以采用以下兩種處理方式提取細胞核，客戶可根據(jù)實際情況自行選擇。
方案一：將培養(yǎng)皿至于提取預冷的金屬塊上，在培養(yǎng)皿中，用刀片將組織切碎成顆粒狀（芝麻大?。?，加入600 μL預冷的Lysis Buffer，冰上靜置10 min。隨后用40 μm細胞篩過濾切碎的組織至1.5mL EP管中，4℃，300 g離心5 min，去上清，用200 μL預冷的PBS重懸細胞核沉淀。取18 μL細胞核懸液，加入2 μL 0.4%臺盼藍溶液染色，顯微鏡下鏡檢，用血球計數(shù)板計算細胞核的濃度。(刀片切割：細胞核懸浮液體積200 μL，細胞核濃度約750個/μL；細胞篩研磨：細胞核懸浮液體積1000 μL，細胞核濃度約2000個/ μL)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，取50000細胞核懸液，加50 μL預冷的PBS，4℃，300g離心3 min去除上清，收集細胞核。
方案二：取一個干凈的50 mL離心管，插入冰中，去掉管蓋，將40 μm細胞篩放在管口，用鑷子將培養(yǎng)皿中清洗完成的組織放置于細胞篩中央處。取少量預冷的PBS（200 μL左右，覆蓋組織塊即可）滴加到組織處，用注射器黑色的活塞頭輕輕的研磨分散組織（研磨2圈后，觀察組織分散情況，每研磨2圈加入500 μL-1000 μL預冷的PBS沖洗組織塊，總計研磨4-6圈左右，此時，50 mL離心管中溶液呈乳白色，細胞篩表面有一層組織覆蓋）。將離心管中溶液轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，4℃，300 g離心5 min，去上清，用600 μL預冷的Lysis Buffer重懸細胞核沉淀，冰上靜置5min。4℃，300 g離心5min，去上清，用1000 μL預冷的PBS重懸細胞核沉淀，隨后用40 μm細胞篩過濾重懸后的細胞核至1.5 mL EP管中。
表1-2 組織lysis buffer配方
4. 取18 μL細胞核懸液，加入2 μL 0.4%臺盼藍溶液染色，顯微鏡下鏡檢，用血球計數(shù)板計算細胞核的濃度。(刀片切割：細胞核懸浮液體積200 μL，細胞核濃度約750個/μL；細胞篩研磨：細胞核懸浮液體積1000 μL，細胞核濃度約2000個/ μL)；
5. 根據(jù)計數(shù)結(jié)果，取50000細胞核懸液，加50 μL預冷的PBS，4℃，300g離心3 min去除上清，收集細胞核；
6. 處理好的細胞核立即進行Tn5轉(zhuǎn)座法DNA建庫。
表1-3不同處理方式得到的細胞核
ATAC-seq建庫實驗
ATAC實驗-轉(zhuǎn)座酶片段化（0.5 h-1 h）
1.于無菌 PCR 管中配制表 2 所示反應體系，配制好后冰上放置；
2. 將配制好的 Transposition Mix 加入到處理好的細胞核中，使用移液器輕輕吹打 5-8 次混勻；
【注】：吹打時盡量輕柔緩慢，不要產(chǎn)生氣泡，否則會對細胞核造成損傷。也不要離心，否則會導致細胞核聚集，導致片段化不充分。
將上述 PCR 管置于 PCR 儀中，設置表 3 所示反應程序，進行片段化反應。
4. 將反應結(jié)束后的 PCR 管瞬離，立即向每個樣本中加入 5 μL 的 Terminate Solution，用移液器輕柔吹打 20 次混勻，室溫靜置 5 min。
ATAC實驗-基因組 DNA 回收（0.5 h）
1. 將平衡至室溫的 DNA Extract Beads 磁珠，渦旋振蕩混勻；
2. 吸取 130 μL DNA Extract Beads 至 55 μL 終止后的片段化產(chǎn)物中，渦旋混勻或用移液器吹打混勻 10 次，室溫靜置孵育5 min；
3. 短暫離心，將離心管置于磁力架上靜置 3 min，待磁珠貼壁后吸凈 PCR 管中溶液；
4. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，從另一側(cè)加入 200 μL 80%乙醇，避免直接沖洗磁珠，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；
5. 保持 PCR 管始終處于磁力架中，再次加入 200 μL 80%乙醇，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；
6. 保持 PCR 管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥至磁珠剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過 3 min)；
7. 從磁力架上取下 PCR 管，加入 25 μL ddH2O，并充分渦旋，室溫靜置 5 min；
8. 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后(約 3-5 min)，小心轉(zhuǎn)移 23 μL 上清至新的 PCR 管中， 進行后續(xù)的文庫擴增或者-20℃保存。
文庫擴增（0.5 h-1h）
1. 將表 4 中試劑解凍后顛倒混勻，瞬離后置于冰上備用；
2. 于無菌 PCR 管中配制表 4 所示反應體系；
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底；
4. 將 PCR 管置于 PCR 儀中，設置表 5 所示反應程序，進行 PCR 擴增。
文庫分選（0.5 h）
由于起始細胞量以及不同種類細胞的染色質(zhì)開放狀態(tài)差異，文庫大小可能存在不同的分布模式。通過磁珠分選，文庫中的大 片段可以有效去除，使得文庫片段分布在 200-700 bp 左右。
1. 進行雙輪分選的比例推薦 0.55×/1.0×，吸取 27.5 μL (0.55×Beads:DNA=0.55:1)平衡至室溫的 DNA Clean Beads 至步驟 5.5 的 PCR 反應產(chǎn)物中，渦旋混勻或用移液器吹打混勻 10 次，室溫靜置孵育 5 min；
2. 短暫離心，將 PCR 管置于磁力架上靜置 5 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至新的 PCR 管中(殘留 3-5 μL，避免吸到磁珠)；
3. 渦旋振蕩混勻 DNA Clean Beads 并吸取 50 μL(1.0×，Beads:DNA=1:1)至上清中，渦旋混勻或移液器吹打混勻 10 次， 室溫靜置孵育 5 min；
4. 短暫離心，將 PCR 管置于磁力架上靜置 3 min，待磁珠貼壁后吸凈 PCR 管中溶液；
5. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，從另一側(cè)加入 200 μL 80%乙醇，避免直接沖刷磁珠，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中 溶液；
6. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，再次加入 200 μL 80%乙醇，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；
7. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，開蓋空氣干燥至磁珠剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過 3 min)；
8. 從磁力架上取下 PCR 管，加入 21 μL ddH2O，并充分渦旋，室溫靜置 5 min；
9. 將 PCR 管短暫離心，置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后(約 3-5 min)，小心轉(zhuǎn)移 20 μL 上清至新的 EP 管中，于-20℃保存。
文庫質(zhì)量控制
通常情況下，對構(gòu)建好的文庫進行濃度和長度分布檢測，具體請參見注意事項，主要包括：
a. 濃度檢測：用 Qubit 對文庫的濃度進行檢測。
b. 質(zhì)量檢測：用 Qsep 或者安捷倫 2100 檢測文庫片段分布。
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hieff NGS® ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina®ATAC建庫試劑盒 | 12208ES12/48 | 12 T/ 48 T |
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®Tn5建庫專用接頭 | 12416ES24/96 | 48 T/ 192 T |
1×dsDNA HS Assay Kit | 12642ES60/76 | 100 T/500 T |
Qubit專用檢測管 | 83509ES03/10 | 500支/5000 支 |
PCR金屬磁力架 | 80460ES03 | 個 |
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