DNA甲基化修飾在維持正常細(xì)胞功能、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、遺傳印記、胚胎發(fā)育、及腫瘤和疾病的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用。5mC可以導(dǎo)致基因沉默或基因表達(dá)水平降低，而5hmC則會(huì)導(dǎo)致基因激活或基因表達(dá)水平增高，研究表明腫瘤抑癌基因的過甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。因此，分析基因組的甲基化水平具有重要的臨床意義。

隨著分子檢測(cè)的不斷發(fā)展，甲基化qPCR檢測(cè)以及甲基化NGS檢測(cè)已成為非常普及的檢測(cè)技術(shù)，這兩種技術(shù)的必經(jīng)之路就是甲基化轉(zhuǎn)化，甲基化轉(zhuǎn)化從方法學(xué)上可分為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和酶法轉(zhuǎn)化，近幾年，基于DNA甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準(zhǔn)的甲基化檢測(cè)試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡(jiǎn)便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。這些甲基化檢測(cè)試劑采用的轉(zhuǎn)化方法為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成為DNA甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有很多局限性，例如過長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化時(shí)間、嚴(yán)重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉(zhuǎn)化不全等。

圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉(zhuǎn)化為U的化學(xué)反應(yīng)概要

2024年1月2日，芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對(duì)DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進(jìn)行快速，準(zhǔn)確檢測(cè)的測(cè)序方法，簡(jiǎn)稱為UBS-seq。該技術(shù)比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程加速20-30倍，同時(shí)明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的背景干擾。

圖2.UBS-seq法在微量樣本中應(yīng)用，傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化相比有更低的背景噪音

翌圣生物的Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技術(shù)開發(fā)優(yōu)化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性。

圖3.Superfast DNA Methylation Bisulfite的技術(shù)原理及優(yōu)勢(shì)

Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）將DNA變性與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化融合為一步，5分鐘內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化，約30 min可完成BS轉(zhuǎn)化全流程。采用柱內(nèi)脫硫技術(shù)，使操作流程更為簡(jiǎn)單；可以滿足100 pg-2 μg樣品的轉(zhuǎn)化；未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的轉(zhuǎn)化率≥99%；轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物適用于PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序等下游應(yīng)用。

圖4.Superfast BS轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程

使用12225與競(jìng)品A和競(jìng)品B轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，轉(zhuǎn)化樣本為200 ng和2 μg的FFPE DNA，F(xiàn)FPE DNA中參入1% λ DNA，轉(zhuǎn)化后的樣本采用甲基化單鏈DNA建庫（12221ES），如圖5所示：12225對(duì)不同投入量的FFPE DNA中 λ DNA C的轉(zhuǎn)化率＞99.5%。

使用12225與競(jìng)品B和競(jìng)品C轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，300 ng樣本為不含甲基化 λ DNA，800ng樣本為人基因組DNA，轉(zhuǎn)化后采用Qubit ssDNA定量，洗脫體積均為30 μL，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物采用甲基化轉(zhuǎn)化特異性引物探針PCR，片段大小為286bp，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，如圖6所示：12225的樣本回收率優(yōu)于競(jìng)品B和競(jìng)品C，且轉(zhuǎn)化后的甲基化特異性引物擴(kuò)增效果 優(yōu)。

圖6.12225和競(jìng)品的回收率

使用12225和競(jìng)品A轉(zhuǎn)化試劑盒分別對(duì)gDNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后使用甲基化單鏈建庫試劑盒（12221ES）建庫，文庫產(chǎn)量和質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)如圖6所示：12225和競(jìng)品A轉(zhuǎn)化后相同的文庫pooling測(cè)序，12225下機(jī)數(shù)據(jù)量更多，ontarget_ratio(%)更高，Dup(%)更低。

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