為了實(shí)現(xiàn)基因組編輯，CRISPR/Cas系統(tǒng)的組件需要進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)揮作用，可以通過(guò)遞送不同形式的Cas和向?qū)NA（gRNA）來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括質(zhì)粒DNA（pDNA），mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）三種生物形式。

pDNA通常被用作非病毒DNA傳遞的載體，其介導(dǎo)的CRISPR技術(shù)是將Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入單個(gè)或多個(gè)pDNA載體之中。因pDNA具有易構(gòu)建、操作簡(jiǎn)便以及成本效益高等優(yōu)點(diǎn)，成為了備受矚目的基因編輯方法。目前廣泛應(yīng)用的Cas9質(zhì)粒包含兩個(gè)表達(dá)盒，一個(gè)是密碼子優(yōu)化的Cas9，一個(gè)是嵌合的gRNA。與我們細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)一致，含有CRISPR系統(tǒng)元件的pDNA需先進(jìn)入細(xì)胞核，隨后轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，最后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中以啟動(dòng)后續(xù)的蛋白質(zhì)合成過(guò)程。

mRNA介導(dǎo)的CRISPR基因編輯技術(shù)，其核心在于將Cas9 mRNA與gRNA共同精準(zhǔn)地遞送至靶細(xì)胞。相較于傳統(tǒng)的pDNA轉(zhuǎn)染方式，mRNA的遞送方式能夠更為迅速地啟動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程。與pDNA的應(yīng)用策略不同，基于mRNA的編輯策略要求同時(shí)遞送Cas9 mRNA和gRNA這兩種關(guān)鍵的組分。Cas9 mRNA的制備主要依賴(lài)于體外轉(zhuǎn)錄（IVT）技術(shù)，并經(jīng)過(guò)加帽和加尾修飾，以確保其穩(wěn)定性和翻譯效率。gRNA作為另一重要組件，存在雙鏈和單鏈兩種形式。雙鏈形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同構(gòu)成，這兩部分需要通過(guò)退火過(guò)程形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過(guò)化學(xué)合成的方式分別制備crRNA和tracrRNA，進(jìn)而組裝成完整的雙鏈gRNA。而單鏈形式的gRNA則是將crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一個(gè)單一的分子，無(wú)需退火過(guò)程。單鏈gRNA可以通IVT或化學(xué)合成的方式獲得，兩種方法各有利弊，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行靈活選擇。

IVT作為一種廣泛應(yīng)用的gRNA生產(chǎn)方法，因其成本效益高、產(chǎn)量大以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛的推廣和應(yīng)用?；瘜W(xué)合成gRNA是利用高通量化學(xué)合成平臺(tái)來(lái)完成的，通過(guò)在gRNA的5’和3’端各加入3個(gè)硫代和甲氧基修飾，不僅可以提高gRNA的穩(wěn)定性，還能有效降低脫靶效應(yīng)，從而提高基因編輯的精確性和安全性。

在CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用中，直接遞送Cas9蛋白與gRNA，從而繞過(guò)pDNA或mRNA在細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程，無(wú)疑是實(shí)現(xiàn)高效基因編輯的優(yōu)選方法。這種基于蛋白的遞送方式同樣依賴(lài)于兩個(gè)核心成分：Cas9核酸酶與gRNA，首先將Cas9蛋白與gRNA結(jié)合，形成帶有負(fù)電荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白（Cas9 RNP）復(fù)合物，隨后將Cas9 RNP作為單一組分進(jìn)行遞送。這種技術(shù)不僅簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，更提高了基因編輯的效率和準(zhǔn)確性。

圖1. CRISPR-Cas9的三種生物形式[1]

 

三種生物形式的差異

每種CRISPR系統(tǒng)的生物形式都有的物理、化學(xué)、生理特性。

Cas9 pDNA表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性，相比之下，mRNA的穩(wěn)定性較差，可通過(guò)對(duì)其核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾提升mRNA的穩(wěn)定性。Cas9 RNP由蛋白質(zhì)和gRNA組成，其結(jié)構(gòu)使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解，因此是最不穩(wěn)定的形式。

當(dāng)Cas9的pDNA進(jìn)入細(xì)胞后，它需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程，最終產(chǎn)生Cas9蛋白。而Cas9的mRNA則更為直接，僅需被傳遞至細(xì)胞質(zhì)中，便可啟動(dòng)翻譯過(guò)程生成Cas9蛋白。隨后Cas9蛋白與gRNA組裝為復(fù)合體發(fā)揮編輯作用。相較之下，RNP形式能夠直接入核進(jìn)行編輯，無(wú)需經(jīng)歷上述復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。因此，遞送Cas9 RNP成為了細(xì)胞基因組編輯中最為直接且高效的策略，通常也被認(rèn)為是最為理想的編輯方法。

在基因組編輯應(yīng)用中，CRISPR/Cas復(fù)合物僅在基因組修飾發(fā)生期間暫時(shí)需要，其在細(xì)胞中過(guò)度存在會(huì)增加脫靶事件的風(fēng)險(xiǎn)。Cas9 RNP和mRNA在細(xì)胞內(nèi)的存在時(shí)間相對(duì)較短，有助于降低脫靶效應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。而Cas9 pDNA能夠介導(dǎo)更長(zhǎng)時(shí)間的基因表達(dá)，可能會(huì)增加脫靶編輯事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于遞送基因編輯器到體內(nèi)的AAV系統(tǒng)的包裝上限約為4.7 kb，因此尋找更小的基因編輯系統(tǒng)對(duì)于其高效體內(nèi)遞送具有重要意義。目前不同的Cas系統(tǒng)均有小型Cas蛋白被開(kāi)發(fā)，如Cas9系統(tǒng)中來(lái)自金黃色釀膿葡萄球菌中的SaCas9（1000多個(gè)氨基酸）；Cas12系統(tǒng)中的AaCas12b和BhCas12b（1100多個(gè)氨基酸）；Cas14(又稱(chēng)Cas12f1，500個(gè)氨基酸) 、Cas12j（又稱(chēng)CasΦ，700氨基酸）；Cas13系統(tǒng)中的Cas13bt（~800氨基酸），基因編輯已進(jìn)入迷你時(shí)代。

CRISPR/Cas系統(tǒng)常見(jiàn)的三種應(yīng)用模式pDNA、mRNA和RNP各有優(yōu)缺點(diǎn)。從張鋒、劉如謙的最新發(fā)文來(lái)看，未來(lái)RNP形式的蛋白遞送或?qū)⒊蔀槔^mRNA之后的下一個(gè)焦點(diǎn)。

表1.CRISPRs生物形式對(duì)比

CRISPR系統(tǒng)的三種遞送技術(shù)

CRISPR系統(tǒng)的生物形式各異，因此其遞送方法也呈現(xiàn)出多樣性。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送策略已發(fā)展出多種方法，主要分為三大類(lèi)別：生物遞送方法、化學(xué)遞送方法以及物理遞送方法。

圖2. CRISPR技術(shù)不同的遞送方式[2]

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，病毒載體扮演著至關(guān)重要的角色。其中，AAV、慢病毒以及桿狀病毒載體都是常用的遞送工具。值得一提的是，AAV已經(jīng)成為體內(nèi)基因治療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的遞送載體，并成功獲得批準(zhǔn)，遞送CRISPR組件至人體用于疾病治療。

AAV之所以備受青睞，源于它能夠輕易地跨越物種屏障感染細(xì)胞，同時(shí)其免疫原性極低，大大降低了引發(fā)炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，任何事物都有其局限性，AAV載體的最大包裝容量?jī)H為4.7kb，這對(duì)于體積龐大的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，無(wú)疑是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。尤其是當(dāng)Cas9蛋白攜帶效應(yīng)蛋白時(shí)，更是需要采取特殊的修改措施，如使用體積較小的SaCas9或?qū)⑦f送系統(tǒng)分割為兩個(gè)載體，才能實(shí)現(xiàn)在AAV載體中的有效加載。

慢病毒作為能感染分裂和非分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒，也常用作遞送載體。由于慢病毒的10kb負(fù)載能力，整個(gè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)都可以加載到其中，但慢病毒隨機(jī)整合入宿主基因組可能引發(fā)免疫反應(yīng)，甚至致癌。

盡管病毒載體遞送系統(tǒng)已將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于臨床，但其療效仍受限于多重因素，如患者免疫反應(yīng)、載荷大小限制、重復(fù)給藥難度及長(zhǎng)期基因表達(dá)等問(wèn)題。因此，科研人員正積極探索新的遞送策略，其中LNP-mRNA等非病毒系統(tǒng)備受矚目。

脂質(zhì)載體是一種很有前景的CRISPR-Cas9系統(tǒng)遞送載體，通常由四種脂類(lèi)組成：陽(yáng)離子型（或電離型）脂類(lèi)、聚乙二醇脂類(lèi)、輔助磷脂和膽固醇。LNP的核心技術(shù)在于其具有pH依賴(lài)性的陽(yáng)離子化脂質(zhì)。在遞送階段，這種脂質(zhì)能夠在中性pH環(huán)境下保持中性狀態(tài)，與周?chē)某煞趾椭C共處。然而，一旦進(jìn)入酸性環(huán)境，如細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體，它便會(huì)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)離子狀態(tài)。這種電荷狀態(tài)的轉(zhuǎn)變不僅能夠誘導(dǎo)粒子解離，還能夠破壞核內(nèi)體膜，從而大大增強(qiáng)其從核內(nèi)體逃逸的能力。這種機(jī)制不僅提高了遞送效率，還有效地降低了全身毒性，使得LNP成為一種安全且高效的遞送工具。

目前，已有多款基于LNP-RNA的療法成功獲得FDA的批準(zhǔn)，這充分證明了LNP技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的可行性和有效性。

圖3. LNP組成[2]

盡管LNP在臨床實(shí)踐中已展現(xiàn)出作為基因編輯納米顆粒遞送系統(tǒng)的先進(jìn)性，然而，眾多其他類(lèi)型的納米載體同樣具備潛力，可巧妙地設(shè)計(jì)以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。例如，聚合物納米顆粒、蛋白質(zhì)衣殼遞送系統(tǒng)以及類(lèi)病毒顆粒（VLP）等，均為這一領(lǐng)域的研究者提供了新的遞送策略。

在本文中，我們向您介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的三種生物形式及遞送方法，這些基礎(chǔ)知識(shí)鋪墊了對(duì)CRISPR技術(shù)的理解，為我們了解其在廣泛領(lǐng)域應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。請(qǐng)繼續(xù)關(guān)注我們的系列文章，在接下來(lái)的文章中，我們將帶您了解CRISPR/Cas技術(shù)在細(xì)胞基因治療、農(nóng)業(yè)等不同領(lǐng)域中的應(yīng)用，更多精彩內(nèi)容，不容錯(cuò)過(guò)，敬請(qǐng)期待！

參考文獻(xiàn)：

[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich L?chelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192

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