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Smart-seq2：單個細胞以及微量細胞轉(zhuǎn)錄組建庫成功的保障
單細胞技術(shù)哪家強，翌圣生物來幫忙。
單細胞技術(shù)介紹
單細胞測序技術(shù)，簡單來說，就是在單個細胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組水平進行測序分析的技術(shù)。傳統(tǒng)的測序，是在多細胞基礎(chǔ)上進行的，實際上得到的是一堆細胞中信號的均值，丟失了細胞異質(zhì)性（細胞之間的差異）的信息。而單細胞測序技術(shù)能夠檢出混雜樣品測序所無法得到的異質(zhì)性信息，從而很好的解決了這一問題。
單細胞技術(shù)類型
單細胞技術(shù)類型很多，有單細胞轉(zhuǎn)錄組、單細胞基因組、單細胞表觀組（單細胞ATAC、單細胞CUT&Tag、單細胞甲基化、單細胞Hi-C等）、單細胞蛋白組、單細胞代謝組等，各種技術(shù)不斷迭代，檢測靈敏度也不斷提升。
在眾多細胞技術(shù)中，應(yīng)用廣泛的當屬單細胞轉(zhuǎn)錄組了。
單細胞轉(zhuǎn)錄組也分為低通量的smart-seq1/2/3和高通量的微流控和微孔板等研究。
今天我們要介紹的主角是Smart-seq2
單細胞技術(shù)類型
Smart-seq技術(shù)于2012年由Ramsk?ld團隊發(fā)表；
Smart-Seq2技術(shù)于2013年及2014年由Picelli團隊改進并發(fā)表；
Smart-seq3技術(shù)則于2020年由瑞典卡羅林斯卡學院的Rickard團隊進一步改進并發(fā)表。
雖然Smart-seq技術(shù)也迭代了多個版本，但是迄今為止，Smart-Seq2是使用最多且被廣泛認為更穩(wěn)定的技術(shù)類型，也是國內(nèi)市場眾多科技服務(wù)公司推崇的技術(shù)之一。
Smart-seq2技術(shù)原理
Smart-seq2關(guān)鍵技術(shù)原理有：
MMLVRT
使用的MMLV具有鏈置換活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性。其在逆轉(zhuǎn)錄到達mRNA 5’端末端時，會在新合成的cDNA的3’末端多出幾個C堿基；
TSO引物序列
TSO引物的5’端含有1個通用引物序列，而在其3’端，有兩個核糖鳥苷（rG）和一個鎖核苷酸（LNA）修飾的鳥苷（G），可以促進模板轉(zhuǎn)換，進而擴增出完整的cDNA序列；
某些物種RNA中有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)形結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)容易形成空間位阻影響逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，添加甜菜堿和海藻糖能在一定程度上增加酶的熱穩(wěn)定性，同時破壞RNA的空間位阻。同時，甜菜堿和Mg2+同時存在，能在一定程度上提高cDNA產(chǎn)量。
Smart-seq2技術(shù)流程
Smart-seq2單細胞分離方法
單細胞分離方法很多，有梯度稀釋法、口吸管移液法、自動顯微操作法、顯微切割法、流式分選法等，不同的方法對比如下：
方法 | 描述 | 優(yōu)點 | 缺點 |
梯度稀釋法 | 梯度稀釋細胞懸液至每孔一個細胞 | 方法簡單，無需專業(yè)設(shè)備 | 耗時，分離得到的細胞可能是多個細胞 |
口吸管移液法 | 使用玻璃毛細管分離單細胞 | 方法簡單 | 操作困難，具有隨機行 |
自動顯微操作法 | 使用自動微量移液管分離單細胞 | 可在位置放置細胞 | 需要專業(yè)設(shè)備 |
激光顯微切割 | 使用激光從組織切片中分離單細胞 | 保留了空間關(guān)系 | 技術(shù)上有難度，有潛在UV損傷 |
FACS | 使用電荷分離含有單細胞的微滴 | 根據(jù)細胞大小、形態(tài)、內(nèi)部復(fù)雜性和蛋白表達（通過抗體標記）準確篩選細胞類型 | 需要昂貴的專業(yè)設(shè)備，細胞處于高壓條件下 |
Smart-seq2技術(shù)與其他單細胞技術(shù)對比
單細胞技術(shù)除了Smart-seq、Smart-seq2和Smart-seq3之外，還有CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRBseq。文章Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023從不同角度來對單細胞技術(shù)進行評估，綜合來看，Smart-seq2更勝。
測序質(zhì)量對比
圖.不同單細胞技術(shù)的測序質(zhì)量對比
六種測序方法都有比較好的測序質(zhì)量，均超過 50% 的數(shù)據(jù)成功被 mapping到。另外，可以明顯發(fā)現(xiàn)基于全長測序方案的 Smart-seq 較 UMI，外顯子區(qū)域的 reads 更多，其中 smart-seq2 有 48% 的 reads 比對到外顯子區(qū)域（如下圖）。這表明 Smart-seq2（48% reads 比對到外顯子）和 Smart-seq（30% reads 比對到外顯子）較 UMI 方案（均低于 15% reads 比對到外顯子）有更好的測序質(zhì)量。
基因檢測效率對比
圖.不同單細胞技術(shù)測序深度和基因檢出數(shù)對比
采用抽樣的飽和度分析對測序深度進行評估，當測序深度達到 100 萬reads時，這六種測序方法均可達到飽和，但明顯 Smart-seq2 具有更好的基因檢測效率。
單個細胞進行實驗時的敏感度對比
圖.不同單細胞技術(shù)基因檢出情況對比
在相同的單個細胞進行單細胞建庫，相同的測序深度下，檢測單細胞中基因表達數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 敏感度最好，達到中位數(shù) 9138/cell，而低的是 Drop-seq 和 MARS-seq，分別約為 4811/cell 和 4763/cell。
多個細胞進行實驗時的敏感度對比
圖.不同數(shù)量的細胞進行微量細胞建庫時基因檢出情況對比
多個細胞建庫后的reads合在一起進行生信分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 仍然具有更多的基因被檢測到，MARS-seq 仍然具有最少的基因被檢測到，這與單細胞敏感度檢測是一致的。
單細胞建庫結(jié)果重復(fù)性對比
圖.不同單細胞技術(shù)建庫后的相關(guān)性分析
利用 92 個已知的外源 ERCC 轉(zhuǎn)錄本，進一步采用線性模型擬合了觀測的表達值與已知濃度的相關(guān)系數(shù)（R2）。通過分析發(fā)現(xiàn)，這六種方法的相關(guān)系數(shù)都較高，都高于 0.80 的相關(guān)系數(shù)。這表明這六種方法的準確度都較好，但 Smart-seq2 的相關(guān)系數(shù)為 0.91，而 MARS-seq 相關(guān)系數(shù)為 0.83。
不同單細胞技術(shù)的Drop out對比
圖.不同單細胞技術(shù)Drop out結(jié)果對比
對至少 65 個單細胞分析中發(fā)現(xiàn)，13361 個基因在 25% 的細胞中至少被一種方法檢測到表達，那么挑選這些基因進行分析，MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率（74%），而 Smart-seq2 （26%），此時說明 Smart-seq2 具有更好的敏感度，這與之前的敏感度也是對應(yīng)的。
看了以上結(jié)果，是不是對Smart-seq2技術(shù)更心動了呢，如果你有需求，聯(lián)系翌圣獲取詳情吧！
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