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蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工，做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法，其實和跑正常蛋白沒什么出入，只不過孵育的是識別磷酸化的抗體。下面恒遠生物帶大家總結(jié)一下實驗中的注意要點。
一、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液問題蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應，取樣品的過程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理最好在冰上操作，操作時間盡量短。用PBS洗滌細胞時，PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話，提取蛋白時采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前預冷，保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸。
二、關(guān)于WB時背景和條帶的問題
磷酸化蛋白WB時背景也往往較深，所以壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則背景太深蓋住想要的那條帶，時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時，除了目標蛋白的條帶以外，往往會出現(xiàn)非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的條帶，反而沒有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據(jù)Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
三、關(guān)于蛋白總的表達量問題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個膠，壓內(nèi)標。但是一般不建議如此做，因為這樣比較時誤差還是較大的。因此，比較常用的方法，即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內(nèi)標。
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