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干貨 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染原理及應(yīng)用全面解讀
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源DNA或RNA導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中的過(guò)程。這一過(guò)程可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，包括化學(xué)法轉(zhuǎn)染、物理法轉(zhuǎn)染、生物法轉(zhuǎn)染等。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在生命科學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用，例如基因表達(dá)研究、功能研究、基因治療和藥物開(kāi)發(fā)等。通過(guò)轉(zhuǎn)染，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯、蛋白質(zhì)表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)研究等，為揭示細(xì)胞機(jī)制、開(kāi)發(fā)新藥和治療疾病提供了重要工具。
真核生物的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核中，蛋白質(zhì)合成發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。因此，一個(gè)真核信使RNA必須從細(xì)胞核中被運(yùn)出來(lái)才能被翻譯成多肽。而原核細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，所以它們的轉(zhuǎn)錄和翻譯都在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。
圖1.真核&原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和RNA加工流程[1]
細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：
是指將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，目的基因能夠入核，并整合到宿主細(xì)胞基因組中，通過(guò)藥物加壓篩選，只保留成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞，使其在細(xì)胞分裂和傳代過(guò)程中持續(xù)穩(wěn)定地存在和表達(dá)。通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA能夠遺傳給后代細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因表達(dá)。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指將外源DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，使其在一段有限的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，但是不能隨細(xì)胞傳代而持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常使用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑或物理方法（如電穿孔、微注射等）導(dǎo)入外源DNA，并使其在短暫的時(shí)間內(nèi)表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。
常用轉(zhuǎn)染方法及應(yīng)用
目前轉(zhuǎn)染方法主要包括物理方法、化學(xué)方法及生物方法，轉(zhuǎn)染方法的選擇取決于細(xì)胞類(lèi)型以及研究目的，即使相同的細(xì)胞，不同的轉(zhuǎn)染試劑之間也有較大差異，所以在使用新細(xì)胞系時(shí)，系統(tǒng)評(píng)估轉(zhuǎn)染條件至關(guān)重要[2,3]。
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圖2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染示意圖[4]
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有何異同
相同點(diǎn)：針對(duì)質(zhì)粒DNA，不論是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，都可以通過(guò)物理法（電轉(zhuǎn)、顯微注射、基因槍?zhuān)?，化學(xué)法（陽(yáng)離子脂質(zhì)體，陽(yáng)離子聚合物、磷酸鈣），生物法（病毒介導(dǎo)）進(jìn)行轉(zhuǎn)染；并且轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)的操作基本一致。
差異點(diǎn)：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建所用質(zhì)粒，一定是包含抗性基因，便于后續(xù)加壓篩選；瞬轉(zhuǎn)所用的質(zhì)?？梢园剐曰蛞部梢圆话剐曰颉?/span>
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常見(jiàn)誤區(qū)
誤區(qū)一
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因會(huì)整合到染色體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不會(huì)
首先我們要了解基因從DNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程：DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞后會(huì)入核，DNA在細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，和基因的選擇性表達(dá)等，轉(zhuǎn)錄出mRNA；mRNA通過(guò)核孔來(lái)到細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上，通過(guò)高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等加工，在空間上通過(guò)折疊，反轉(zhuǎn)，螺旋等方式形成空間結(jié)構(gòu)。從而形成具有生物活性的蛋白質(zhì)。一般會(huì)分為胞內(nèi)表達(dá)、分泌型、單次跨膜及多次跨膜不同形態(tài)。
所以不管是瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)，DNA都會(huì)入核并有一定概率隨機(jī)整合到宿主染色體；的區(qū)別在于，穩(wěn)轉(zhuǎn)所用的質(zhì)粒含有抗性基因，后期是通過(guò)藥物篩選，把沒(méi)有轉(zhuǎn)進(jìn)目的基因的細(xì)胞殺死，保留下來(lái)的就是成功轉(zhuǎn)入目的基因的細(xì)胞，所以通過(guò)一定時(shí)間的藥物篩選，保存下來(lái)的細(xì)胞都是能夠穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞，稱(chēng)之為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染由于沒(méi)有藥物加壓篩選，加上僅有少量的細(xì)胞中有目的基因整合到染色體，所以在傳代的過(guò)程中，陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少，導(dǎo)致表達(dá)量逐漸降低，進(jìn)而不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。
圖3.蛋白表達(dá)模式圖[5]
誤區(qū)二
只有慢病毒感染才能構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株
能夠用來(lái)做瞬轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染方法，都可以用來(lái)做穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建，比如電轉(zhuǎn)、化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染、慢病毒感染等，只不過(guò)三種轉(zhuǎn)染方法在具體的應(yīng)用上會(huì)有一定差異；需要注意的是RNA轉(zhuǎn)染，由于RNA不需要入核，所以針對(duì)RNA轉(zhuǎn)染一般只是做瞬轉(zhuǎn)表達(dá)。
誤區(qū)三
構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株費(fèi)時(shí)費(fèi)力，周期長(zhǎng)，不確定性高，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室不方便構(gòu)建
1、細(xì)胞株構(gòu)建需要通過(guò)藥物加壓篩選，與瞬轉(zhuǎn)相比周期長(zhǎng)，但在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)，確定了一個(gè)長(zhǎng)期研究的靶標(biāo)，后續(xù)都會(huì)針對(duì)某一基因進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，那么這個(gè)時(shí)候構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株就顯得尤為必要，畢竟細(xì)胞株相較于瞬轉(zhuǎn)來(lái)說(shuō)，最大的優(yōu)點(diǎn)就是表達(dá)穩(wěn)定性高，批間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性更高。
2、有的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較低，通過(guò)瞬轉(zhuǎn)的方式，很難獲得足夠的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞株，就可以提高陽(yáng)性率，獲得足量穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株。
3、有的人可能會(huì)覺(jué)得構(gòu)建細(xì)胞株周期太久，結(jié)果不可控；其實(shí)，在我們構(gòu)建細(xì)胞株時(shí)，通常會(huì)在轉(zhuǎn)染后48h進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)以及初步的功能驗(yàn)證，這個(gè)時(shí)候我們就可以知道是否轉(zhuǎn)染成功，就可以知道細(xì)胞株構(gòu)建是否會(huì)成功；至于操作難度，這里也可以給大家分享實(shí)驗(yàn)protocol（具體操作如下）。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建操作流程：
1、重組質(zhì)粒構(gòu)建：按照實(shí)驗(yàn)室的需求，將目的基因構(gòu)建到含有抗性基因的載體中（如pLVX-puro），進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，獲得目的質(zhì)粒，最終拿到的質(zhì)粒，濃度最好不低于1000 ng/μL，濃度過(guò)低會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
2、細(xì)胞準(zhǔn)備：在轉(zhuǎn)染前一天傳代細(xì)胞，保證在第二天能夠有70%左右的匯合度（具體情況可根據(jù)細(xì)胞而定）。
3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染即可。
4、細(xì)胞檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后48h，取部分細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)量或功能檢測(cè)，初步判斷是否轉(zhuǎn)染成功，若失敗，查找失敗原因；若成功，則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5、細(xì)胞鋪板：細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照10/100/1000個(gè)細(xì)胞每孔鋪板96孔板（鋪板數(shù)量可以梯度測(cè)試），鋪板培養(yǎng)基需要含有篩選藥物；不建議直接在原細(xì)胞中直接加入藥物進(jìn)行篩選，這樣會(huì)降低細(xì)胞存活率。
6、克隆挑選：細(xì)胞鋪板后14天，顯微鏡觀察克隆生長(zhǎng)情況，并將陽(yáng)性克隆移至12孔板繼續(xù)培養(yǎng)（根據(jù)細(xì)胞量轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞培養(yǎng)板即可）。
7、克隆檢測(cè)：按照實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行表達(dá)量或功能驗(yàn)證，篩選出若干個(gè)優(yōu)選克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞大量擴(kuò)培后，可再進(jìn)行一次復(fù)檢。
8、細(xì)胞建庫(kù)：按照實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行細(xì)胞建庫(kù)，如果需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株，可以在優(yōu)選克隆基礎(chǔ)上按照單個(gè)細(xì)胞每孔進(jìn)行二輪篩選。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染常見(jiàn)FAQ
問(wèn)
質(zhì)粒：首先要確保我們序列的準(zhǔn)確性，其次是質(zhì)粒的高純度；質(zhì)粒濃度最好不低于1000 ng/uL（該濃度只是建議濃度，低濃度也可以成功轉(zhuǎn)染，只不過(guò)轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所降低）。
細(xì)胞類(lèi)型：要保證是一個(gè)健康狀態(tài)的細(xì)胞；不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)染方法和試劑的敏感性不同，因此轉(zhuǎn)染效率也會(huì)有差異。
轉(zhuǎn)染方法：按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件摸索，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
問(wèn)
如果瞬轉(zhuǎn)效率比較低，這時(shí)會(huì)推薦構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以通過(guò)藥物加壓篩選，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株，提高陽(yáng)性率，解決轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題。
問(wèn)
目前主要有物理方式，化學(xué)試劑及病毒等轉(zhuǎn)染方式；通常物理轉(zhuǎn)染需要昂貴的儀器及復(fù)雜的轉(zhuǎn)染參數(shù)，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法滿(mǎn)足；化學(xué)試劑是目前比較通用的一種方法，因其價(jià)格便宜，操做簡(jiǎn)單，被廣泛使用，不過(guò)該類(lèi)產(chǎn)品一般只能轉(zhuǎn)染比較常規(guī)的細(xì)胞，針對(duì)個(gè)性化腫瘤細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降，所以針對(duì)較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，主要是通過(guò)慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；當(dāng)然，如果細(xì)胞本身就是那種非常難轉(zhuǎn)染的，慢病毒也不一定會(huì)有很高的轉(zhuǎn)染效率。
問(wèn)
不需要，質(zhì)粒線(xiàn)性化和未線(xiàn)性化均可，親測(cè)兩種差異不大。
問(wèn)
報(bào)告基因細(xì)胞株構(gòu)建流程和上述細(xì)胞株構(gòu)建方法基本一致，首先需要確定所用報(bào)告基因質(zhì)粒是正確（涉及到具體的信號(hào)通路），根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，選用適合的轉(zhuǎn)染方法，按照質(zhì)粒載體上標(biāo)注的抗性基因進(jìn)行藥物篩選即可。（翌圣生物提供上百種報(bào)告基因質(zhì)粒產(chǎn)品可供選擇）
相關(guān)產(chǎn)品
針對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，翌圣可以提供多款轉(zhuǎn)染試劑，能夠匹配更多應(yīng)用場(chǎng)景，如常規(guī)DNA轉(zhuǎn)染、siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染及病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑等，其中PEI轉(zhuǎn)染試劑能夠提供GMP級(jí)別產(chǎn)品，支持項(xiàng)目申報(bào)。
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 應(yīng)用 |
Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES | 轉(zhuǎn)染DNA，文章高引用產(chǎn)品 |
Hieff Trans®siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES | 轉(zhuǎn)染siRNA/miRNA |
Calcium Phosphate Cell Transfection Kit 磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 | 40803ES | 轉(zhuǎn)染DNA，效率高，成本低 |
Polyethylenimine Linear (PEI) MW40000（rapid lysis） 線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑（速溶型）MW40000 | 40816ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（粉末） |
Hieff Trans® PEI轉(zhuǎn)染試劑 | 40820ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（科研級(jí)） |
Hieff Trans® PEI Transfection Reagent-GMP | 40821ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（GMP級(jí)） |
參考文獻(xiàn)
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