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            FISH探針的制備

            來源:自然基因科技有限公司   2024年05月10日 10:40  


            熒光原位雜交(FISH)探針的制備

             

            實驗原理

             

            染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合,這種結(jié)合開創(chuàng)了一門新的學(xué)科——分子細胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southern blot原理,以半抗原如生物素標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針,探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交,互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA,通過熒光標記的親和素將半抗原顯示出來,通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點,可同時分析分裂期和間期的多個細胞,并進行定量;可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型;還可以使用多種熒光標記,顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向,空間定位精確。

             

            002.jpg

             

            實驗步驟


            003.jpg

             

            第一天

            缺口平移標記探針

            1. 試劑準備

               1) 0.1mmol/L dNTP

            0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等體積混合。

               2) 0.1mmol/L dTTP

            1倍體積的0.3mmol/L dTTP和2倍體積的三蒸水混合。

            2. 缺口平移體系和反應(yīng)條件

            0.1mmol/L dTTP 6.5μl

            0.1mmol/L dNTP 10μl

            10× Nick Translation buffer 5μl

            1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl

            Nick Translation Enzyme 10μl

            DNA (1μg) X μl

            H2O 18-X μl

            in total 50μl

            以上為標記1μg DNA的缺口平移體系,若標記更多量的DNA,則試劑量和反應(yīng)體系相應(yīng)等倍擴大。各成分混勻后短時離心。對于≤10kb的質(zhì)粒,于15℃反應(yīng)3.5小時;對于BAC/PAC,于15℃反應(yīng)9小時。

            3. 凝膠電泳判斷探針大小

            將EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加熱5分鐘后行2 %瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標記探針的大小,單一序列探針合適大小為200~600bp;如片段大小偏大,則于15℃延長反應(yīng)10~30分鐘,再重復(fù)進行凝膠電泳,直至得到合適大小的探針。

            4. 終止反應(yīng)

            向反應(yīng)體系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加熱5分鐘,以滅活酶。探針于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

            第二天

            1. 探針的沉淀和變性

               1) 探針混合物的組成

                  a. 對BAC/PAC探針

            DNA探針 5ul

            Human Cot-1 DNA 3ul

            Salmon Sperm DNA 0.5ul

            H2O 1.5ul

            in total 10ul

                  b. 對著絲粒探針:

            DNA探針 5ul

            Salmon Sperm DNA 0.5ul

            H2O 4.5ul

            in total 10ul

               2) DNA的沉淀

            將探針混合物與1ul(V/10)3M醋酸鈉(PH5.2)和27.5ul(2.5V)無水乙醇(-20℃凍存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀過夜),以14000g在4℃離心30min,以沉淀DNA。

               3) 清洗沉淀

            小心棄去上清,用70 %乙醇洗滌一次,再次以14000g在4℃離心15min;小心棄去上清,在45~50℃的中溫水浴中風(fēng)干DNA沉淀10~15min。

            注:當大部分乙醇蒸發(fā)時,白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?;?wù)必清除乙醇,否則會在加入Master Mix后產(chǎn)生微小的沉淀,導(dǎo)致高背景。

               4) 溶解探針

            加入5μl 預(yù)熱至37℃的去離子甲酰胺(PH 7.0),短時離心后在37℃振搖30min以充分溶解DNA;再加入預(yù)熱至37℃的Master Mix 5μl,短時離心后在37℃振搖15~30min。

            注:振搖時間盡可能延長;DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4μl稀釋,混勻后瞬時離心,37℃振搖15~30min。

               5) 探針的變性和預(yù)雜交

            短時離心后于80℃水浴中變性探針10min,冰浴5分鐘;短時離心,于37℃水浴中預(yù)雜交30~60min;序列探針(如cDNA)和重復(fù)序列探針(如α-衛(wèi)星DNA)探針,無需預(yù)雜交。

            2. 標本(染色體靶DNA)的處理和變性

               1) 滴片和老化

            取出儲存于-20℃的細胞懸液標本,以1100 rpm.離心10min沉淀細胞,換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重懸細胞并調(diào)整細胞密度,滴片,劃出雜交區(qū)域,晾干;在預(yù)熱到 37℃的2×SSC中老化30min(也可實驗前夜室溫過夜老化再以2×SSC浸泡2分鐘);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脫水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脫水后涼干”)。

               2) RNase A消化

            每張玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(將10mg/ml的RNase A儲存液稀釋100倍),蓋上22×22mm蓋玻片,置于37℃濕盒中孵育1小時;室溫下2×SSC中振蕩洗滌,5min/次×3次;梯度乙醇脫水后涼干。

               3) 靶DNA的變性

            將玻片放入預(yù)溫至72℃(每增加一張玻片,溫度要提高1℃)的70 %去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后,立即置入預(yù)冷至-20℃保存的梯度乙醇脫水晾干。

               4) 蛋白酶消化

            將50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(終濃度為0.01 %)加入預(yù)溫至37℃的50ml蒸餾水(PH 2.0,以適量稀鹽酸酸化)中,混勻;將變性后的玻片放入其中處理10分鐘;室溫下1×PBS中振蕩洗滌,5min/次×2次;室溫下梯度乙醇脫水后涼干。

            注:靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同步進行,完成后盡快進行雜交。

            3. 雜交

            將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域,蓋上22mm×22mm蓋玻片,封片后置于濕盒中,37℃雜交過夜。

            第三天

            1. 雜交后洗滌和半抗原信號放大

               1) 雜交后洗片

            小心揭去封片膠和蓋玻片,將玻片置于預(yù)熱至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸;每張玻片滴加30 μl阻斷液1,蓋上22mm×22mm蓋玻片,于37℃濕盒中孵育30min;再次將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

            注:此后步驟應(yīng)注意避光操作。

               2) 滴加一抗

            將4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中,混勻;每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域,蓋上22mm×22mm蓋玻片,于37℃濕盒中孵育1小時;室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

               3) 滴加二抗

            將4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中,混勻;每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域,蓋上22mm×22mm蓋玻片,于37℃濕盒中孵育40min;室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

               4) 滴加三抗

            將4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中,混勻;每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域,蓋上22mm×22mm蓋玻片,于37℃濕盒中孵育30min;室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

            注:以上步驟按雙色FISH描述,若為單色FISH則選擇相應(yīng)抗體即可。

            2. 核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片

            將1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(終濃度為125 ng/ml,避光保存于4℃),混勻;將玻片置于其中,避光復(fù)染2min;2×SSC中洗滌5min;梯度乙醇脫水晾干;每張玻片滴加10 μl 抗熒光淬滅劑封片,蓋上22mm×22mm蓋玻片,-20℃避光保存。

            3. 熒光顯微鏡檢測FISH雜交信號

            以熒光顯微鏡觀察,在DAPI/FITC/Texas Red濾光鏡激發(fā)下觀察中期/間期細胞的熒光雜交信號,計數(shù)細胞和采集圖像。每例分析100~200個間期細胞核細胞,重疊、破損、未去除細胞質(zhì)和雜交信號微弱的細胞核不計入其中。對于雙色雙融合FISH,細胞內(nèi)雜交信號相互靠近(<1/10核直徑的距離)者計為一個信號。

            4. 儲存數(shù)據(jù)

             

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