產(chǎn)品名稱：abcam重組Drebrin抗體[EPR12634] (ab178408)現(xiàn)貨供應(yīng)

產(chǎn)品貨號(hào)：ab178408

產(chǎn)品品牌：abcam

實(shí)驗(yàn)流程：

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案：

1. 樣品裂解

l 從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備裂解物

(1) 將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在冰上，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。

(2) 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解緩沖液（每 10 mL7細(xì)胞/100 mm 培養(yǎng)皿/150 cm2瓶;每 5x10 0.5 mL6細(xì)胞/60 mm 培養(yǎng)皿/75 cm2燒瓶）。

(3) 使用冷塑料細(xì)胞刮刀從培養(yǎng)皿上刮下貼壁細(xì)胞，然后輕輕地將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的微量離心管中?；蛘?，在微量離心管中的裂解緩沖液中重懸之前，可以胰蛋白酶消化并用PBS洗滌細(xì)胞。

(4) 在 4°C 下保持恒定攪拌 30 分鐘。

(5) 在4°C的微量離心機(jī)中離心細(xì)胞懸液。 您可能需要根據(jù)細(xì)胞類型改變離心力和時(shí)間;指南是在 14,000–17,000 g 下 5 分鐘，但這必須為您的實(shí)驗(yàn)確定（白細(xì)胞需要非常輕的離心）。

(6) 輕輕地從離心機(jī)中取出試管并放在冰上，吸出上清液并放入保持在冰上的新鮮試管中，然后丟棄沉淀。

l 從組織中制備裂解物

(1) 用干凈的工具解剖感興趣的組織，最好在冰上解剖，并盡快防止蛋白酶降解。

(2) 將組織放入圓底微量離心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中以快速冷凍。將樣品儲(chǔ)存在 -80°C 以備后用，或放在冰上立即均質(zhì)化。對(duì)于~5mg組織，向試管中快速加入~300μL冰冷裂解緩沖液，用電動(dòng)均質(zhì)器勻漿，用另一個(gè)2×200μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次，然后在4°C下保持恒定攪拌2小時(shí)（例如，放在冰箱中的軌道振蕩器上）。裂解緩沖液的體積必須根據(jù)存在的組織量來確定;蛋白質(zhì)提取物不應(yīng)太稀釋，以免蛋白質(zhì)損失和大量樣品上樣到凝膠上。濃度下限為 0.1 mg/mL，最佳濃度為 1–5 mg/mL。

(3) 在微量離心機(jī)中以 14,000–17,000 g 在 4°C 下離心 5–10 分鐘。輕輕地從離心機(jī)中取出試管，放在冰上，吸出上清液，然后放入保持在冰上的新鮮試管中;丟棄顆粒。

2. 樣品制備

(1) 除去少量裂解物以進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。確定每種細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度。

(2) 確定要加載多少蛋白質(zhì)并加入等體積的 2X Laemmli 樣品緩沖液。

(3) 我們建議使用以下方法對(duì)樣品進(jìn)行還原和變性，除非在線抗體數(shù)據(jù)表表明應(yīng)使用非還原和非變性條件。

(4) 為了減少樣品和變性，將每個(gè)細(xì)胞裂解物在樣品緩沖液中在100°C下煮沸5分鐘。裂解物可以等分并儲(chǔ)存在 -20°C 以備將來使用。

3. 抗體染色

(1) 使用封閉緩沖液在室溫下封閉膜1小時(shí)或在4°C下過夜。

(2) 在封閉緩沖液中用適當(dāng)稀釋的一抗孵育膜。我們建議在 4°C 下孵育過夜;其他條件可以優(yōu)化。

(3) 用三次TBST洗滌膜，每次5分鐘。

(4) 在室溫下，在封閉緩沖液中用推薦的偶聯(lián)二抗稀釋液孵育膜1小時(shí)。

(5) 用三次TBST洗滌膜，每次5分鐘。

(6) 對(duì)于信號(hào)開發(fā)，請(qǐng)遵循套件制造商的建議。去除多余的試劑并用透明保鮮膜覆蓋膜。

(7) 使用用于化學(xué)發(fā)光的暗室顯影技術(shù)或用于比色檢測(cè)的普通圖像掃描方法獲取圖像。

相關(guān)文獻(xiàn)：

[1] Brezovakova V et al. Astrocytes Derived from Familial and Sporadic Alzheimer's Disease iPSCs Show Altered Calcium Signaling and Respond Differently to Misfolded Protein Tau. Cells 11:N/A (2022).

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