圖1.PBCV DNA Ligase反應原理示意圖

PBCV DNA Ligase的連接活性遠優(yōu)于傳統(tǒng)T4 DNA 連接酶，并對以 RNA 為夾板的 DNA 底物表現(xiàn)的出親和力（表觀 Km = 1 nM，Km值越小表示親和力越強），從而能夠?qū)碗s混合物中的 RNA 種類進行亞納摩爾級檢測。因此，該酶非常適合應用于高靈敏度RNA檢測，包括各種SNP的miRNA、mRNA和非編碼RNA的定性或定量檢測，以及用于二代測序和分子診斷。接下來，小編給大家介紹下PBCV DNA Ligase的神奇應用吧！

空間轉(zhuǎn)錄組學能夠繪制出組織中特定轉(zhuǎn)錄本的位置，識別特定基因的表達位置，從而可以從分子層面更全面地研究組織，目前主要的空間轉(zhuǎn)錄組技術包括：

如表所示，原位測序是一種在細胞或組織中直接進行mRNA序列分析的空間轉(zhuǎn)錄組技術。該技術通過特制探針與目標mRNA雜交，利用滾環(huán)擴增（RCA）在特定位置生成信號，接著用熒光染料標記來識別具體序列，已實現(xiàn)保留基因表達的空間信息的目的。今天，小編主要以Mip-seq為例，介紹下PBCV DNA Ligase在原位測序中的應用。Mip-Seq技術通過PBCV DNA Ligase連接構建RCA模板，接著RCA擴增以放大信號，并結合多輪測序以實現(xiàn)高通量檢測，能夠以亞細胞分辨率有效解析DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小分子等多種生物分子，可用于檢測腫瘤基因突變和親本基因的等位基因特異性表達，從而實現(xiàn)精確的腫瘤診斷。

MiP-Seq技術路線如下：

圖2. Mip-seq原理圖[1]

分子檢測，特別是核酸檢測，因其快速、靈敏和精準而受到青睞，但無論是標準qPCR技術還是等溫擴增技術都需要一定的實驗設備，限制了病原體檢測的普及性應用。為此，張鋒名下的診斷公司Sherlock Bioscience開發(fā)了一款無需儀器、可在環(huán)境溫度下實現(xiàn)精確且多重核酸檢測的INSPECTR核酸檢測技術[2]，其應用不僅局限于傳染病診斷，還擴展到檢測抗微生物肽、單核苷酸多態(tài)性等方面。

INSPECTR核酸檢測技術原理如下：

圖2. NSPECTR原理圖原理圖[2]

除了上述應用，PBCV DNA Ligase也被應用于EXTRA-CRISPR技術[3]（Cas12介導的高靈敏度miRNA檢測）以及SELECT技術[4]（基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法）等。在EXTRA-CRISPR技術中，該酶通過連接形成RCA模板，為隨后的RCA擴增和信號增強提供了基礎，顯著提升了Cas12系統(tǒng)對miRNA的檢測敏感性。而SELECT方法則是借助m6A修飾可阻止PBCV DNA Ligase連接兩個寡核苷酸的特性，在經(jīng)過幾輪m6A選擇后，含m6A的RNA模板產(chǎn)生的連接產(chǎn)物顯著少于未修飾的RNA模板，接著通過qPCR可進行精確定量分析。這些應用實例充分展示了PBCV DNA Ligase在原位測序、RNA檢測等方面的廣闊應用前景。

翌圣團隊潛心研發(fā)，通過翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor™酶進化平臺（了解更多），成功推出PBCV DNA Ligase（Cat#14962）。翌圣PBCV DNA Ligase來源于Chorella virus，其蛋白純度＞95%，無核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留，特別適用于原位測序、高靈敏核酸檢測等應用場景。

無核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留

將3個批次的翌圣PBCV DNA Ligase (Cat#14962ES)與底物DNA在37℃孵育4 h（125 U 投入量），以及與底物RNA在37℃孵育16 h（25 U 投入量）。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，翌圣PBCV DNA Ligase無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。同時，利用磷酸酶檢測盒對3個批次的PBCV DNA Ligase進行檢測，4 h反應后，酶活(µmol/min)數(shù)據(jù)顯示翌圣PBCV DNA Ligase磷酸酶殘留極低（<0.0001）。

圖3. 核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留檢測