細(xì)胞凍存是指將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，以達(dá)到減少細(xì)胞代謝的作用，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存進(jìn)行保種的目的，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)或臨床使用。細(xì)胞凍存一般采用慢凍原則，慢凍可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞不會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生大的冰晶而收到損害。

一、原理

當(dāng)溫度低至-70℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)及酶活性幾乎全部停止，低于-130℃時(shí)，細(xì)胞能達(dá)到最佳存活率。液氮可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長(zhǎng)期保存。

冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過(guò)程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

二、貼壁細(xì)胞凍存操作步驟

1、預(yù)熱凍存液；

2、用PBS沖洗細(xì)胞，加入胰酶消化（此步驟同細(xì)胞傳代操作）；

3、終止消化后，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管，1000rpm離心5min；

4、棄上清，加入預(yù)熱的細(xì)胞凍存液，細(xì)胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；

6、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過(guò)夜；

7、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

三、懸浮細(xì)胞凍存操作步驟

1、用移液管將細(xì)胞懸液吹吸均勻，將細(xì)胞懸液移入離心管；

2、1000rpm離心 3 min，收集細(xì)胞沉淀；

3、用預(yù)熱的凍存液重懸細(xì)胞，細(xì)胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；

5、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過(guò)夜；

6、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

貼壁細(xì)胞凍存操作示意圖

注意事項(xiàng)：

①　細(xì)胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作。

②　傳代時(shí)需要適度的消化，消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③　傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行。

④　細(xì)胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中。

⑤　應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，并且活力達(dá)90%以上處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。

⑥　程序凍存盒、細(xì)胞凍存液、全培養(yǎng)基等試劑都要復(fù)溫至室溫備用。

⑦　凍存前注意切勿消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、吹打力度過(guò)重、離心轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免造成細(xì)胞損傷。

⑧　凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時(shí)水會(huì)滲入造成污染。

⑨　細(xì)胞不可長(zhǎng)期保存在-80℃冰箱中，放置時(shí)間不要超過(guò)3天。

⑩　液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。