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在合理區(qū)間內，Ct值小，感覺美滋滋，但Ct值大的時候，可能就難受了≧ ﹏ ≦
今天小翌就給大家分享一下如何應對Ct值偏大的問題~
Ct值，即循環(huán)閾值（Cycle Threshold），是指熒光定量PCR實驗中熒光信號超過背景噪音水平時的循環(huán)次數(shù)，是最重要的關鍵參數(shù)，可用于分析基因表達差異、計算基因拷貝數(shù)或者實驗質量控制等等。
從圖表上我們可以看到的是熒光閾值和擴增曲線交點的橫坐標即為Ct值。其中出現(xiàn)的熒光閾值一般是基線的標準差的10倍，在實際操作中也可以手動調節(jié)。
而Ct值與模板量、產物量之間的關系為：
擴增產物量Xn=起始模板量X0×（1+擴增效率En）循環(huán)個數(shù)n
其中En表示的是擴增效率。當擴增產物量增長到一定量級后，所發(fā)出的熒光信號等于熒光閾值，此時的循環(huán)個數(shù)則為Ct值。由計算方式可以了解到，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，當擴增產物量為定值時，起始模板量越大，Ct值越?。黄鹗寄０辶吭叫?，Ct值越大。
但是小伙伴們要注意，Ct值不是恒定不變的，不同的樣本、不同的儀器會對該數(shù)據(jù)有一定的影響，有時即使是相同的樣品在相同的儀器上重復2-3遍，Ct值也會存在差異。
Ct值的范圍通常在15-35之間。當Ct值小于15，則認為在基線期擴增范圍內，未達到熒光閾值。當Ct值大于35時，不適宜用于定量，僅能做定性判斷。但是有不少小伙伴表示，Ct值在30以上心里就很難受了，數(shù)據(jù)使起來不痛快，為什么會出現(xiàn)大的Ct值呢？
上文中有提到關系等式：
擴增產物量Xn=起始模板量X0×（1+擴增效率En）循環(huán)個數(shù)n
可以發(fā)現(xiàn)要達到一定的擴增產物量，Ct值同起始模板量和擴增效率En有一定的關系。
不同的小伙伴對于起始模板的投入量有不同的選擇，例如選擇將cDNA原液稀釋10倍后作為反應模板上機檢測；直接選擇cDNA原液作為反應模板上機檢測；又或者在進行反轉錄時選用100ng RNA或1000ng RNA進行反轉錄。
不同的反應模板量會對Ct值造成影響，模板量越多，Ct值越小,而模板量越少，Ct值就越大。10倍的模板量差異，對應的Ct值差異約在3.3個循環(huán)數(shù)(23.33=10)。
理論情況下，模板量投入越多，Ct值會變得越小，但實際操作時要注意！小伙伴們在閱讀反轉錄試劑或者熒光定量試劑說明書時，會發(fā)現(xiàn)模板投入量都會存在上限。例如反轉錄時模板RNA投入量不建議超過2000ng，熒光定量PCR時投入的cDNA原液體積不能超過總反應體系的1/10。切記不要盲目為了減少Ct值無限制地增加模板投入量。模板本身除了包含核酸外，還有其他潛在的上游反應殘留物或抑制物，量大時會對下游反應造成一定的抑制作用。
理論情況下，PCR擴增將1個DNA分子變成2個DNA分子，擴增效率為100%。但實際情況下，由于PCR反應中存在抑制因素，導致擴增效率低于100%，而一些污染、非特異擴增或者引物二聚體會導致擴增效率高于100%。
通常建議選用擴增效率在90%-110%之間的反應體系進行實驗測試?？吹竭@，小伙伴會問，我如何知道我的反應體系擴增效率在多少？
通常獲取真實的擴增效率需要通過預實驗制作標準曲線，通過制作標準曲線，獲取曲線斜率，從而換算出擴增效率。
標準曲線制作案例：以染料法熒光定量檢測A基因
盡量準備高濃度的待測cDNA或質粒DNA，于室溫中瞬離混勻備用。根據(jù)個人需求按照一定梯度稀釋核酸樣本，一般建議6-8個梯度。
每個梯度做3個技術重復，配制大體系平均分配至小體系準確定會更高。期間也要注意混勻，槍頭的替換和氣泡排除等操作細節(jié)。
上機后，熒光定量PCR儀器會根據(jù)輸入的信息進行標準曲線作圖和換算。
觀察標準曲線的斜率是否落在-3.58~-3.10之間以及相關系數(shù)R2是否≥0.98。(斜率折算成擴增效率的算法：擴增效率=10(-1/斜率)-1)
選用擴增效率在90%-110%之間的反應體系，當然，越接近100%越好。當擴增效率下降5%時，對應的Ct值大約會增加1。當擴增效率較低，在80%以下時，Ct值會明顯偏大。
首先，小伙伴們，當Ct值偏大，尤其在30以上時，切記先不要慌，先保存好辛苦做出來的數(shù)據(jù)，冷靜下來后細心分析下數(shù)據(jù)，看看數(shù)據(jù)本身是否合理且可使用！若復孔Ct值的STD＜0.2且熔解曲線單峰，則表明該數(shù)據(jù)是可靠的，可用于數(shù)據(jù)分析。
當Ct值大于30且復孔STD值＞0.2時，若其本身為低表達基因且在其他研究或發(fā)表文獻中都得到驗證，可嘗試將技術重復從3管提升至5-6管。再次上機后，剔除其中差異較大的技術重復，選用STD值最小的復孔數(shù)據(jù)。
目標模板濃度偏低
a. 通過增加反轉錄時RNA的投入量從而提高模板濃度，或減少cDNA模板稀釋度，理論上每稀釋10倍，Ct值增大3.3。
b. 模板降解的風險，選用新鮮的RNA或分裝保存好的未開封RNA進行反轉錄獲取新的cDNA。選擇高產高穩(wěn)的RNA提取試劑及反轉錄試劑。
c. 若基因本身表達豐度就很低，嘗試選用高靈敏的qPCR試劑來進行熒光定量PCR。
擴增片段過長
a.擴增產品片段不要過長，選擇產物長度在80-300bp之間的。
b.可嘗試標準的三步法擴增提高長片段的擴增效率。但是要注意片段長度很長的，該方法效果不大，建議選用方法a。
擴增效率異常，嚴重偏離100%±10%
a. 做好引物設計，避免二級結構、發(fā)夾結構和錯配，減少非特異擴增。
b. 確保RNA純度達標(OD260/280、OD260/230)，減少抑制物對于反應的影響。
c. 若原采用cDNA原液作為模板，可嘗試對cDNA原液進行一定比例稀釋后進行分析。
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[1] Li Y, Wang D, Ping X, et al. Local hyperthermia therapy induces browning of white fat and treats obesity. Cell. 2022;185(6):949-966.e19.doi:10.1016/j.cell.2022.02.004.(IF=66.850)
[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
[11] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021;39(12):1581-1588. doi:10.1038/s41587-021-00982-9.(IF=68.164)
[12] Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regulates blood cholesterol levels in humans and mice. Cell Res. 2020;30(4):363-365. doi:10.1038/s41422-020-0303-z.(IF=46.297)
[13] Wang Z, Lu Z, Lin S, et al. Leucine-tRNA-synthase-2-expressing B cells contribute to colorectal cancer immunoevasion. Immunity. 2022;55(6):1067-1081.e8. doi:10.1016/j.immuni.2022.04.017.(IF=43.474)
[14] Bi Q, Wang C, Cheng G, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022;55(8):1466-1482.e9. doi:10.1016/j.immuni.2022.06.018.(IF=43.474)
[15] Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile Temperature Critically Controls the Differentiation and Pathogenicity of T Helper 17 Cells. Immunity. 2020;52(2):328-341.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.006.(IF=43.474)
[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
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