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解決方案 | NGS接頭選擇大揭秘，解鎖你的高通量測(cè)序之旅！
構(gòu)建基因文庫(kù)是整個(gè)高通量測(cè)序（NGS）過(guò)程中尤為關(guān)鍵的一步，基因文庫(kù)的質(zhì)量將直接影響后續(xù)測(cè)序工作。接頭（Adapter）是NGS文庫(kù)構(gòu)建環(huán)節(jié)的關(guān)鍵部分，其中包含的 Index 序列用于區(qū)分不同樣本，使得單次測(cè)序或單個(gè) Flow Cell 通道中允許多個(gè)樣本混合測(cè)序。隨著測(cè)序通量和測(cè)序需求的增加，接頭種類(lèi)上從單端Index、雙端組合型index接頭到UDI接頭，甚至達(dá)到上千種index 種類(lèi)，包裝形式上也從傳統(tǒng)的管式接頭到適配自動(dòng)化建庫(kù)的板式包裝接頭延伸。與此同時(shí)，兼容市面上主流的Illumina&MGI平臺(tái)的通用接頭也層出不窮，解決不同應(yīng)用場(chǎng)景下的NGS接頭需求。
接頭的常見(jiàn)類(lèi)型
根據(jù)樣本身份Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭
單端Index接頭：指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端）；
雙端Index接頭：指的在P5和P7端均存在Index。比單端Index能容納更多數(shù)目的樣本，被廣泛使用。
根據(jù)接頭是否匹配PCR-free建庫(kù)可以將接頭分為長(zhǎng)接頭和短接頭
長(zhǎng)接頭又稱(chēng)為完整接頭：以Illumina平臺(tái)接頭為例，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過(guò)TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可以直接上機(jī)測(cè)序（但是當(dāng)DNA量不夠時(shí)還需進(jìn)行PCR擴(kuò)增使得產(chǎn)物達(dá)到一定的量方可上機(jī)測(cè)序）；
短接頭又叫不完整接頭：通過(guò)TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有完整的文庫(kù)結(jié)構(gòu)后才能上機(jī)測(cè)序。
Index作為接頭中的重要組成部分，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)Index是混合樣本中不同樣本的“身份”，其本身就是一段堿基序列，一般長(zhǎng)6nt或8nt。通過(guò)對(duì)這種“身份”的識(shí)別，就可以在混合樣本中對(duì)單個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別。Index的選擇通常需滿(mǎn)足兩個(gè)原則：堿基平衡和熒光信號(hào)平衡。
堿基平衡，指的是Index的復(fù)雜度和平衡度，是多個(gè)Index之間的平衡。組合的原則是：同一組index中的A/T/C/G四種堿基都需要包含，且這4種堿基的比例接近，各占25%左右。
熒光信號(hào)平衡，是指在不能保證堿基平衡的情況下，選擇保證熒光信號(hào)的平衡。在Illumina平臺(tái)中的4通道測(cè)序儀中，dG/dT使用綠色熒光標(biāo)記，dC/dA使用紅色熒光標(biāo)記。測(cè)序時(shí)每個(gè)循環(huán)里綠色和紅色兩種熒光信號(hào)都必須存在以保證測(cè)序順利進(jìn)行。因此在選擇Index時(shí)需要考慮綠色信號(hào)和紅色信號(hào)的平衡。
雙端index之CDI接頭：Combined Dual Index，一對(duì)多的接頭，即可以根據(jù)一定的要求對(duì)兩端的index進(jìn)行組合，最終形成的是雙端index文庫(kù)
雙端index之UDI&UDB接頭：減少index hopping和mis-assignment
兩端index成組設(shè)計(jì)，雙端，兩端可交叉驗(yàn)證。采用雙端index分析數(shù)據(jù)時(shí)，可以將index錯(cuò)誤分配率降低到0.01%，與之前常規(guī)的index排列組合方法對(duì)比，index hopping降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。使用UDI接頭可以大幅度降低illumina測(cè)序過(guò)程中因?yàn)闄C(jī)器測(cè)序或者實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引入的交叉污染，從而盡可能避免測(cè)序數(shù)據(jù)“張冠李戴”的現(xiàn)象。但其實(shí)并非UDI接頭可以防止交叉，而是發(fā)生序列交叉了之后，可以丟棄這部分?jǐn)?shù)據(jù)。
圖4.UDI接頭index排列組合效果圖
UMI接頭：低頻突變檢測(cè)、絕對(duì)定量的利器
UMI接頭包含P5 Index、P7 Index和UMI元件，其中，UMI分子標(biāo)簽可以設(shè)計(jì)為隨機(jī)的核苷酸鏈、部分簡(jiǎn)并核苷酸鏈或者固定核苷酸鏈。根據(jù)UMI標(biāo)簽所在的位置，又可以將UMI接頭分為單端UMI（10 nt）接頭（UMI標(biāo)簽緊隨P7端Index）和雙端UMI（5-8 nt）接頭（UMI標(biāo)簽位于插入片段兩端）。
在UDI接頭結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入U(xiǎn)MI標(biāo)簽，通過(guò)對(duì)原始DNA分子片段進(jìn)行標(biāo)記，能夠驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果在原始DNA序列上的一致性，分辨出檢測(cè)到的突變是真實(shí)的低頻突變還是來(lái)源于測(cè)序錯(cuò)誤和PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤，從而過(guò)濾掉背景噪音，實(shí)現(xiàn)低頻突變的準(zhǔn)確檢測(cè)。
圖5.UMI接頭相關(guān)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品信息
板式包裝接頭
采用自動(dòng)化設(shè)備來(lái)進(jìn)行高通量NGS樣本建庫(kù)，傳統(tǒng)的管式包裝接頭已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足需求。為了更好的匹配當(dāng)前的自動(dòng)化設(shè)備，針對(duì)Illumina和MGI平臺(tái)分別開(kāi)發(fā)了由96微孔板包裝的384 UDI接頭試劑盒。其中，Illumina平臺(tái)為完整型長(zhǎng)接頭，MGI平臺(tái)為截短型接頭。板式包裝接頭搭配自動(dòng)化建庫(kù)試劑盒，可以解決當(dāng)前的手動(dòng)建庫(kù)試劑盒與自動(dòng)化平臺(tái)的兼容性問(wèn)題！
圖6.板式包裝接頭試劑盒和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
接頭產(chǎn)品選擇指南
產(chǎn)品類(lèi)別 | 接頭類(lèi)型 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | Index 種類(lèi) | 貨號(hào) | |
Illumina平臺(tái) | 管式包裝 | 單端index完整長(zhǎng)接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set1/Set2 | 96種 | 13519-13520ES |
雙端Index CDI接頭-DNA | Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®,Set1/Set2 | 384種 | 12412-12413ES | ||
雙端Index CDI接頭-RNA | Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina®,Set1/Set2 | 384種 | 12414-12415ES | ||
雙端Index UMI接頭 | Hieff NGS® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina®，Set1/Set2 | 96種 | 13370-13371ES | ||
轉(zhuǎn)座酶接頭引物 | Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® | 384種 | 12416ES | ||
板式包裝 | 單端index完整長(zhǎng)接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina（板式） | 96種 | 13585ES | |
雙端Index UDI長(zhǎng)接頭 | Hieff NGS® Full UDI Adapter Kit for Illumina® Set1-Set4（板式） | 384種 | 12333-12336ES | ||
雙端Index UDI接頭 | Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® Set1/Set2/Set3/Set4（/Set5-Set8/Set9-Set12板式） | 1152種 | 12327-12332ES | ||
管式包裝 | 通用PE adapter | Hieff NGS® C177P1 PE Adapter for Illumina® | - | 12939ES | |
MGI平臺(tái) | 管式包裝 | 單端index完整長(zhǎng)接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI,Set1/Set2/Set3 | 96種 | 13361-13362ES |
雙端Index UMI接頭 | Hieff NGS® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI®,Set1/Set2 | 96種 | 13367-13368ES | ||
板式包裝 | 單端index完整長(zhǎng)接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI® | 96種 | 13585ES | |
雙端Index UDB接頭 | Hieff NGS® Unique Dual Barcode Adapter Kit for MGI®,Set1/Set2/Set3/Set4 | 384種 | 13536-13539ES | ||
通用接頭(Illumina&MGI) | 板式包裝 | 雙端Index UDI接頭 | Hieff NGS® Universal Stubby UDI Primer Kit | 96種 | 12323ES |
相關(guān)產(chǎn)品
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