由于缺乏機體免疫系統(tǒng)等的保護(hù)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有對微生物的防御能力。在體外培養(yǎng)環(huán)境中，有些微生物在攝取營養(yǎng)物質(zhì)方面有競爭優(yōu)勢，并在短時間內(nèi)排出大量代謝產(chǎn)物；有些微生物則附著在細(xì)胞表面或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。因此，微生物污染會對體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生存、生長及功能活動造成極大干擾，嚴(yán)重的可致細(xì)胞死亡。同時，實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性也大打折扣。所以，保持細(xì)胞生存環(huán)境無微生物污染是體外實驗的前提條件。良好的無菌操作可大大降低細(xì)胞培養(yǎng)中的微生物污染風(fēng)險。

    微生物對細(xì)胞的影響因污染物和細(xì)胞種類的不同而表現(xiàn)各異，一般當(dāng)污染物持續(xù)存在時，輕者細(xì)胞增殖生長緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變粗糙，輪廓折光增強；重者細(xì)胞停止增殖，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或從瓶壁脫落。

    若發(fā)生微生物污染，一般應(yīng)及時將被污染的培養(yǎng)物及相關(guān)試劑在滅菌后按正規(guī)程序丟棄，與被污染培養(yǎng)物接觸過的器材也應(yīng)及時消毒滅菌，防止污染的再次發(fā)生。微生物污染的消除非常困難，且應(yīng)保持隔離并嚴(yán)密監(jiān)控，因此不要輕易嘗試消除污染，除非細(xì)胞至關(guān)重要且不可替代。由此可見微生物污染的預(yù)防十分重要。為此，首先介紹如何判斷常見的污染。

    常見污染細(xì)胞的微生物有細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等，不同污染物對細(xì)胞的影響有區(qū)別，真菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)（如48 h）壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)，而支原體和病毒對細(xì)胞形態(tài)和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的。細(xì)菌、真菌的污染可通過肉眼和常規(guī)顯微鏡觀察到，支原體、病毒污染的確定則一般需借助其他檢測方法。

一、細(xì)菌污染

細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)而短（細(xì)胞直徑約0.5 μm，長度約0.5 ~ 5 μm）、結(jié)構(gòu)簡單、細(xì)胞壁堅韌、以二等分類方式繁殖和水生性較強的原核微生物。細(xì)菌增殖速度很快，能短時間在培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)菌，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁（有時靜置的培養(yǎng)基初看不渾濁，但稍加振蕩，就有很多渾濁物漂起；有時在培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)輕微的薄膜或泡沫，或在培養(yǎng)物生長表面出現(xiàn)點狀物，移動培養(yǎng)器皿時則消散）并變?yōu)辄S色（細(xì)菌污染后大多能改變培養(yǎng)基pH）。用倒置相差顯微鏡觀察，視野內(nèi)可見點狀的細(xì)菌顆粒，并可能出現(xiàn)由細(xì)菌遷移引起的閃動，一些細(xì)菌會成團或結(jié)合培養(yǎng)的細(xì)胞。

在細(xì)菌污染初期，若使用了抗生素，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置相差顯微鏡也不易觀察、判斷，此時若懷疑有細(xì)菌污染，可用無抗生素的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)觀察。若未使用抗生素，培養(yǎng)液改變不明顯，但又疑有污染，可取一份培養(yǎng)基樣本接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)檢測。

需注意細(xì)菌污染有時可能會和培養(yǎng)基組分的沉淀或細(xì)胞碎片混淆，但細(xì)菌形態(tài)一致，而沉淀或碎片則形態(tài)不同，并且通常大小不一；細(xì)菌團可能與沉淀的蛋白質(zhì)混淆，但細(xì)菌團內(nèi)可見很多單個或成串的細(xì)菌（特別是晃動后），蛋白質(zhì)沉淀則不然。

細(xì)菌數(shù)量較多時會使原先清晰的培養(yǎng)背景變得模糊，甚至覆蓋培養(yǎng)物，對培養(yǎng)物的生存構(gòu)成直接的威脅。迅速增殖的細(xì)菌，會消耗營養(yǎng)液和產(chǎn)生毒素從而抑制細(xì)胞生長，毒性大的細(xì)菌會很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。

二、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌和病毒之間能獨立生活的最小微生物，無細(xì)胞壁，形態(tài)多變，大小介于0.2 ~ 2 μm之間，多吸附在細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。不同支原體的生物學(xué)性狀有很大差別，一般對熱敏感，對青霉素普遍有抗藥性。由于支原體無致死細(xì)胞毒性且可與細(xì)胞長期共存，故培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，無明顯變化，或有微細(xì)變化卻由于傳代和換液而被緩解。除了細(xì)胞培養(yǎng)狀況不佳，采用常規(guī)顯微鏡并不容易觀察支原體污染，其檢出需借助熒光染色、PCR、ELISA、免疫染色、放射自顯影術(shù)、微生物學(xué)分析等方法，其中采用核酸熒光染料進(jìn)行DNA染色是簡單和最可信的方法之一。

當(dāng)進(jìn)行熒光染色時，在40×或100×物鏡下支原體可被顯示為細(xì)胞質(zhì)上明確的微?；蚪z狀染色，一般大小、性質(zhì)一致，此時同樣被亮染的培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核可作為陽性對照。確定是否存在支原體污染需盡可能多地觀察染色樣本，因為不是所有培養(yǎng)的細(xì)胞都會被污染。

用熒光染色法進(jìn)行支原體檢測時，培養(yǎng)物的細(xì)胞碎片可能會造成假陽性結(jié)果，但細(xì)胞碎片不會出現(xiàn)清晰的點狀或絲狀支原體形態(tài)。若仍不能確認(rèn)，可吸取適量待檢培養(yǎng)基與指示細(xì)胞（為已明確無支原體污染且是支原體的適宜宿主，同時生長良好，有足夠的細(xì)胞質(zhì)以顯示粘附的支原體，如MDCK細(xì)胞）共培養(yǎng)，然后熒光染色來觀察指示細(xì)胞表面是否有支原體，從而避免誤判。

運用熒光染色法有時會觀察到細(xì)胞質(zhì)存在均勻亮染，這可能是由RNA引起的，這類熒光會逐漸變暗，可將染色樣本干燥避光保存后在第2天觀察。如果對熒光檢測的結(jié)果存在懷疑，可重復(fù)檢測或采用其他方法再次檢測。

支原體可黏附在宿主細(xì)胞表面，從細(xì)胞膜獲取脂質(zhì)和膽固醇，造成細(xì)胞膜損傷。支原體能抑制細(xì)胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細(xì)胞抗原性，導(dǎo)致染色體畸變，干擾病毒復(fù)制以及具有類似病毒的作用。不同細(xì)胞對支原體的感受性和反應(yīng)存在差異。

急性支原體污染可能會引起培養(yǎng)細(xì)胞狀況的全面惡化，但很多支原體生長緩慢且不破壞宿主細(xì)胞（特別是連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株），它們可通過很多不同的途徑改變培養(yǎng)物的行為和代謝。若細(xì)胞被支原體長期污染，會出現(xiàn)增殖減慢、飽和密度下降等，污染嚴(yán)重的情況下細(xì)胞會從培養(yǎng)器皿脫落，另外懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞還會出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

三、真菌污染

真菌是一類低等的真核生物，無法進(jìn)行光合作用，以孢子進(jìn)行繁殖，一般有發(fā)達(dá)的菌絲體，異養(yǎng)吸收型，陸生性較強。真菌種類繁多，形態(tài)各異，若發(fā)生真菌污染，大多肉眼可見白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)基表面，短期內(nèi)培養(yǎng)基多不渾濁，某些真菌污染會導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH升高；顯微鏡下觀察，可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫于細(xì)胞之間，懸浮在培養(yǎng)液之中，有時還會產(chǎn)生孢子團，酵母菌和念珠菌則表現(xiàn)為獨立的卵圓形顆粒，并可能出芽。真菌生長迅速，能在短時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞，且會在培養(yǎng)板孔間蔓延而很快波及鄰孔。

（細(xì)胞培養(yǎng)實驗常見微生物污染示例（A）培養(yǎng)中的神經(jīng)細(xì)胞被細(xì)菌污染的早期表現(xiàn)，從胞質(zhì)開始出現(xiàn)形態(tài)改變（↑所示）；（B）桿菌污染的革蘭染色診斷，▲示革蘭陽性桿菌，Δ示細(xì)胞碎片；（C）支原體污染的表現(xiàn)之一，細(xì)胞出現(xiàn)縮和碎片化的改變（↑所示，確診需要結(jié)合分子標(biāo)志物檢測）；（D）霉菌污染，硫堇染色，▲示菌絲，Δ示細(xì)胞碎片。）

四、病毒污染

病毒為一種大小以納米計、不能獨立地利用外界營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自體繁殖的微生物。病毒種類復(fù)雜，相應(yīng)宿主細(xì)胞有特異性，而感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性改變，因此僅靠目測或顯微鏡觀察不能達(dá)到檢測目的。應(yīng)根據(jù)不同的病毒選用不同的方法來檢測，常規(guī)有紅細(xì)胞吸附試驗、動物接種檢查、電子顯微鏡檢查、免疫學(xué)檢測和PCR等，因?qū)俨《緦W(xué)的研究范疇，普通實驗室不易推廣。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，可改變培養(yǎng)物的生物學(xué)性狀，影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長或干擾實驗結(jié)果的客觀性。

為杜絕上述污染，可從以下幾個方面做好預(yù)防工作：

1、培養(yǎng)環(huán)境：

1）無菌室：保持清潔，經(jīng)常擦洗，使污染物不易積聚。

2）超凈臺：①定期維護(hù)和保養(yǎng)，按廠家規(guī)定定期清洗和更換空氣濾器，經(jīng)常保持清潔并用75%乙醇消毒；②操作前提前30 min啟動超凈臺紫外燈消毒；③存放的物品應(yīng)全面消毒，并盡可能只將立即使用的物品放入；④細(xì)胞培養(yǎng)操作時應(yīng)盡量保持層流，避免氣霧狀污染物進(jìn)入培養(yǎng)器皿；⑤操作中濺出的液體應(yīng)及時擦去，并用75%乙醇擦拭消毒；⑥實驗完畢后，移走所有物品，并用75%乙醇擦洗工作臺。

3）二氧化碳培養(yǎng)箱：①由于箱內(nèi)潮濕，溫度適宜，有利于微生物生長，故應(yīng)定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行清潔和消毒處理。將隔板、水盤和可拆卸部分取出，按去污劑擦洗、清水沖洗、消毒劑擦洗、紫外線照射30min的順序處理，然后放回箱內(nèi)；②水盤內(nèi)使用滅菌蒸餾水或添加真菌抑制劑如硫酸銅（會腐蝕不銹鋼等材質(zhì)的水盤）或?qū)Ｓ脺缇?，并注意及時更換新鮮水；③盡量減少開門次數(shù)，降低污染機會；④若取存細(xì)胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，經(jīng)及時用75%乙醇擦拭消毒。

2、物品的消毒滅菌：

①操作前應(yīng)做好所用器皿、試劑的消毒滅菌工作；

②高壓蒸汽滅菌是常用的方法，不能采用此法滅菌的器皿、試劑，應(yīng)采用其他消毒滅菌方法，如培養(yǎng)基等試劑可過濾除菌，蓋玻片等器械可用75%乙醇浸泡消毒后置于無菌環(huán)境中晾干；

③若物品消毒滅菌后長時間未使用，應(yīng)重新處理。

3、個人衛(wèi)生：

操作前洗凈雙手，操作時穿清潔的長外衣，同時佩戴無菌的手套、口罩和帽子，手套經(jīng)常用75%乙醇擦拭消毒。

4、無菌操作：

防止污染的關(guān)鍵在于嚴(yán)格無菌操作。無菌意識不強、動作不準(zhǔn)確、操作不熟練等都會造成污染。注意事項主要如下：

①細(xì)胞培養(yǎng)的操作一定要在超凈臺等層流裝置內(nèi)進(jìn)行，無菌的試劑、器械一定要在無菌區(qū)開封；

②操作時減少交談、咳嗽等防止來自唾沫和呼出氣流造成的污染；

③培養(yǎng)試劑不宜過早開瓶，操作時應(yīng)盡可能保持瓶體傾斜，所有瓶口不能與超凈臺的風(fēng)向相逆，使用后應(yīng)立即封閉瓶口；

④培養(yǎng)的細(xì)胞處理前也不要過早暴露于空氣中；

⑤不要在打開器皿上方操作；

⑥不允許用手觸及器皿的無菌部分（如瓶口、瓶蓋內(nèi)側(cè)）；

⑦吸取液體時應(yīng)專管專用，及時替換；

⑧若無菌器物的頂端接觸到非無菌物品表面，應(yīng)及時更換；

⑨為確保培養(yǎng)物的安全，應(yīng)盡早凍存有價值的培養(yǎng)物；

⑩對新引進(jìn)的細(xì)胞株、血清等生物材料應(yīng)先隔離培養(yǎng)觀察，防止外來的污染源。

5、抗生素：

沒有哪種抗生素都能抑制所有微生物，即使聯(lián)合使用也難以根chu污染?？股貙?xì)胞生長有一定影響，由抑菌引起的共生現(xiàn)象亦可導(dǎo)致實驗假象；持續(xù)使用會導(dǎo)致慢性微生物污染（在這種情況下，微生物被抗生素抑制，但沒有被殺死，它們會在培養(yǎng)體系中存留，大部分時間檢測不到，但當(dāng)條件改變時會再次出現(xiàn)），同時還會使微生物產(chǎn)生抗藥性的幾率大大增加，因此其使用需謹(jǐn)慎，不要讓培養(yǎng)物長期處于抗生素中。只要操作與條件合格，最好不添加。