N6-甲基腺苷（m6A）是高等真核生物信使RNA（mRNA）內(nèi)部豐富的修飾，與人類的發(fā)育，免疫，腫瘤生成和轉(zhuǎn)移，干細(xì)胞更新，脂肪分化等過程息息相關(guān)，目前m6A甲基化修飾已成為科研中一個重要且熱門的研究方向，因此，開發(fā)m6A甲基化的檢測方法也尤為重要。

甲基化RNA免疫共沉淀高通量測序(MeRIP-seq/m6A-seq)是目前研究m6A甲基化修飾使用廣泛的技術(shù)之一。該技術(shù)利用特異性識別m6A甲基化修飾的抗體，對細(xì)胞內(nèi)具有m6A甲基化修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀。然后，對沉淀下來的RNA片段進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，以在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)研究m6A甲基化修飾的情況。盡管MeRIP-seq是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，但因其受到輸入量、抗體特異性、交聯(lián)效率、非定量讀數(shù)等因素影響，MeRIP-seq很難實現(xiàn)對m6A甲基化修飾全轉(zhuǎn)錄組無偏好檢測和絕對定量。

圖1. MeRIP-seq/m6A-seq技術(shù)原理[1]

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，有一種更加準(zhǔn)確、可靠和高效的m6A甲基化修飾檢測技術(shù)出現(xiàn)了，即E. coli tRNA-specific adenosine deaminases（TadA）酶輔助的m6A測序技術(shù)（eTAM-seq）。

TadA是一種來源于大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶，自然界中野生型TadA可對單鏈RNA（ssRNA，主要是轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）內(nèi)的環(huán)區(qū)）或雙鏈RNA（dsRNA）的腺嘌呤脫氨，對DNA無脫氨活性。TadA可以在tRNAArg的單鏈反密碼子環(huán)中將A轉(zhuǎn)化為I，I在DNA的修復(fù)和復(fù)制過程中被讀為G。TadA經(jīng)蛋白改造后重組表達(dá)而來的突變體，也可以用于ssDNA的腺嘌呤高效脫氨。

圖2. TadA作用原理圖

eTAM-seq

在《Nature Biotechnology》雜志上，芝加哥大學(xué)化學(xué)系的湯瑋欣教授、陳夢潔教授和何川教授共同發(fā)表了一篇名為“Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination”的文章。該研究報道了一種基于TadA酶輔助的m6A測序技術(shù)（eTAM-seq），利用了TadA酶的特性，能夠以單堿基分辨率對m6A進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。相較于傳統(tǒng)方法，該方法能有效保持RNA樣本完整性，另外僅需要極少量的RNA樣本，便能夠?qū)崿F(xiàn)對m6A甲基化修飾的精確檢測和定量分析，為表觀轉(zhuǎn)錄組破譯提供了新方法。

圖3. eTAM-seq測序原理[2]

eTAM-seq測序原理與實驗流程

eTAM-seq技術(shù)通過對未被甲基化修飾的A進(jìn)行脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化成I，I能與C配對，在經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)后變?yōu)镚，而甲基化修飾的m6A保留了其甲基化狀態(tài)，仍被檢測為A，從而識別出轉(zhuǎn)錄組中的m6A修飾。具體實驗流程如下：

參考文獻(xiàn)

[1] Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023;4(3):100546.

[2] Xiao YL, Liu S, Ge R, et al. Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination. Nat Biotechnol. 2023;41(7):993-1003.