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新技術(shù)分享：PIP-seq，無需配套儀器的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)！
如火如荼的單細(xì)胞技術(shù)目前被大家廣為接受，而且單細(xì)胞技術(shù)除了在科研研究領(lǐng)域遍地開花，也廣泛應(yīng)用于抗體發(fā)現(xiàn)、藥物評(píng)價(jià)、用藥靶向指導(dǎo)等領(lǐng)域。
現(xiàn)階段，單細(xì)胞測(cè)序方法普遍需要依賴于微孔板裝置、微流體裝置或流體處理。而且微流控、微孔板等裝置價(jià)格不菲，成為單細(xì)胞技術(shù)研究的一大壁壘。
2023年3月6日，Nature Biotechnology上發(fā)表了一篇關(guān)于PIP-seq（Particle-templated instant partition sequencing ）的文章——Clark IC, Fontanez KM, Meltzer RH, et al. Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification. Nat Biotechnol. 2023;41(11):1557-1566. doi:10.1038/s41587-023-01685-z。PIP-seq是一種不需要專門的微流體設(shè)備、專業(yè)知識(shí)或硬件的方法。它基于粒子模板乳化，允許人們僅使用渦旋器在均勻的液滴乳液中對(duì) cDNA 進(jìn)行單細(xì)胞封裝和條形碼。粒子模板即時(shí)分區(qū)測(cè)序 (PIP-seq) 適用于多種乳化形式，包括微孔板和大容量錐形管，可在幾分鐘內(nèi)處理數(shù)千個(gè)樣品或數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
圖.PIP-seq單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程圖
a、乳化過程示意圖。條形碼顆粒模板，細(xì)胞和裂解試劑與油和渦流相結(jié)合，以產(chǎn)生單分散的液滴。
b、細(xì)胞裂解釋放mRNA，mRNA與偶聯(lián)了條形碼以及oligod(T)的beads結(jié)合。
c、除油后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用TSO進(jìn)行后續(xù)的鏈置換步驟。
d、全長(zhǎng)cDNA獲取，cDNA含有條形碼以及Illumina測(cè)序所需序列。
讓我們來看看作者發(fā)表的文獻(xiàn)中PIP-seq的數(shù)據(jù)表現(xiàn)情況吧。
使用人和鼠的混合樣本進(jìn)行PIP-seq實(shí)驗(yàn)，總細(xì)胞捕獲數(shù)為1595個(gè)，其中雙胞細(xì)胞數(shù)為12個(gè)，雙胞率為0.75%
圖.雙胞率檢測(cè)結(jié)果圖
使用健康的乳腺樣本同時(shí)用PIP-seq和10x Genomics V3版本試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PIP-seq能區(qū)分管腔上皮細(xì)胞(LEP1和LEP2)、肌上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管細(xì)胞和免疫細(xì)胞的兩個(gè)譜系。將10x的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)抽取，使其捕獲細(xì)胞數(shù)降至2400個(gè)，每個(gè)細(xì)胞的測(cè)序量維持在36500reads。最終對(duì)比顯示，PIP VS 10x Genomics結(jié)果為，unique gene數(shù)為2298 vs 1757，轉(zhuǎn)錄本數(shù)對(duì)比7491 vs 3394，線粒體占比2.34% vs 1.32%。PIP-seq與10x Genomics結(jié)果進(jìn)行marker基因分析，結(jié)果顯示marker基因分析結(jié)果一致。
圖：使用PIP-seq精確地分析健康乳腺組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜（PIP-seq及10x Genomics結(jié)果對(duì)比）
PIP-seq用于CRISPR篩選
使用PIP-seq進(jìn)行CROP-seq實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PIP-seq能夠用于CRISPR篩選。
圖.使用PIP-seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和gRNA測(cè)序
MPAL復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
圖.細(xì)胞系和人類樣本中耐藥癌癥表型的分子特征
結(jié) 論
該文章作者證明PIP-seq在小鼠-人混合研究中產(chǎn)生高純度的轉(zhuǎn)錄組，與多組學(xué)測(cè)量相兼容，與商業(yè)微流體平臺(tái)相比，可以準(zhǔn)確表征人類乳腺組織中的細(xì)胞類型。使用PIP-seq對(duì)混合表型急性白血病的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析揭示了標(biāo)準(zhǔn)免疫表型所隱藏的化療耐藥細(xì)胞亞群內(nèi)異質(zhì)性的出現(xiàn)。PIP-seq是一種簡(jiǎn)單，靈活和可擴(kuò)展的下一代工作流程，可將單細(xì)胞測(cè)序擴(kuò)展到新的應(yīng)用。
對(duì)于能不使用特定設(shè)備就能完成的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，肯定是會(huì)好評(píng)，但是PIP-seq仍然需要有更多的應(yīng)用才能被市場(chǎng)接受。那有沒有其他技術(shù)是廣被市場(chǎng)認(rèn)可的呢？Smart-seq2當(dāng)仁不讓可稱之為被市場(chǎng)認(rèn)可的無需特定昂貴設(shè)備就能完成的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（ps：前期需要通過單細(xì)胞分選）。Smart-seq2能得到單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列，單個(gè)細(xì)胞的基因檢出數(shù)是目前單細(xì)胞技術(shù)中最高的（可參考Smart-seq2：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞以及微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)成功的保障）。
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