本文介紹伴刀豆球蛋白A，及其與磁珠共價(jià)偶聯(lián)后的ConA磁珠的應(yīng)用場(chǎng)景。

伴刀豆球蛋白A磁珠 （Concanavalin A-Coated Magnetic Beads，簡(jiǎn)稱ConA磁珠），顧名思義，就是植物凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）和超順磁性納米材料進(jìn)行偶聯(lián)的一種生物磁珠。下面將逐一介紹有關(guān)ConA磁珠的那些事兒。

伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是自1936年以來(lái)，第一個(gè)從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結(jié)晶的一種植物凝集素蛋白，無(wú)血型特異性。

ConA根據(jù)所處溶液pH值的不同，主要有2種形式：α-2 同源二聚體或 α-4 同源四聚體[2]。堿性條件下（pH>7.0）以四聚體（四個(gè)分子量為26kDa亞基構(gòu)成）形式存在；酸性條件（pH 4.5-5.5）下，Con A解離為活化的二聚體結(jié)構(gòu)（52kDa）。除此之外，ConA的功能受二價(jià)陽(yáng)離子的影響，如在缺乏金屬離子（Ca2+ 和 Mn2+ ）的情況下，其構(gòu)象、糖蛋白結(jié)合功能是無(wú)法得到發(fā)揮[1]。

圖1.ConA分子模型(A) ConA monomer, (B) ConA dimer, (C) ConA tetramer with mannose, glucose and metal ions

生物磁珠是一類具有納米粒徑大小，由高分子聚合物和無(wú)機(jī)磁性納米粒子形成的磁性微球。磁珠按照其結(jié)構(gòu)可以分為三大類：核-殼型結(jié)構(gòu)、夾層式結(jié)構(gòu)、彌散型結(jié)構(gòu)。磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁性礦、正鐵酸鹽、鐵鈷合金等。

磁性納米材料，因其具備特殊的效應(yīng)，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等，在Fe3O4 納米顆粒的尺寸小于30 nm時(shí), 納米顆粒內(nèi)部熱騷動(dòng)的干擾表現(xiàn)顯著, 此時(shí), 這類納米顆粒就表現(xiàn)出一種特殊的磁學(xué)性質(zhì), 即超順磁性。超順磁性Fe3O4 納米顆粒具備優(yōu)質(zhì)的屬性，如無(wú)毒、良好的生物相容性、獨(dú)特的磁靶向特性以及在交變磁場(chǎng)中易于產(chǎn)熱等性質(zhì), 在生物行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。

而將ConA與微球進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)用于固定生物分子，則有以下優(yōu)勢(shì)：

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，ConA磁珠的主要應(yīng)用分為3種場(chǎng)景，分別是進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)膜分離、糖蛋白富集、和分離固定細(xì)胞方面。

利用ConA磁珠受二價(jià)陽(yáng)離子的激活影響，使其存在于Ca2?和Mg2?溶液環(huán)境中，其具備的末端α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的親和作用功能，用在質(zhì)膜純化方面，是一種簡(jiǎn)便、高效的方式。如細(xì)胞或組織的質(zhì)膜分離，是進(jìn)一步獲取質(zhì)膜蛋白的關(guān)鍵步驟。而ConA是能結(jié)合細(xì)胞上糖基化蛋白，可利用此原理，獲取純度更高的質(zhì)膜。主要操作步驟為：通過(guò)將生物素化的ConA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，將ConA固定在磁珠上；細(xì)胞膜與ConA磁珠孵育1h；磁力架上吸附；TBS洗滌5次；洗脫液洗脫細(xì)胞質(zhì)膜溶液[3]。

圖2. ConA磁珠純化質(zhì)膜步驟

ConA對(duì)甘露糖(mannose)和葡萄糖(glucose)具有特異性，且ConA識(shí)別α-連接甘露糖，這種甘露糖恰好是許多血清和細(xì)胞膜糖蛋白的“核心寡糖”。因此可用在免疫學(xué)等方面的分離細(xì)胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化分子。

主要操作步驟為：通過(guò)雙功能連接劑亞油酸雙- N-羥基琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將氨基硅烷化的磁性納米微珠（ MNPs） 與ConA進(jìn)行交聯(lián)，獲取ConA磁珠；使用甲氧基乙二醇（MEG）終止磁性納米微球的非特異性結(jié)合，進(jìn)行磁分離；將加入用胰蛋白酶消化的細(xì)胞膜蛋白提取液，與ConA磁珠兩者孵育，磁力架收集已結(jié)合糖蛋白的ConA磁珠，洗滌非糖肽，最后洗脫捕獲的糖肽，進(jìn)行真空干燥。通過(guò)該方法，可以對(duì)腫瘤相關(guān)蛋白 (如EGFR) 的特定糖基化位點(diǎn)進(jìn)行深入分析[4]。

圖3. 超順磁性納米顆粒偶聯(lián)不同凝集素

利用ConA磁珠（磁珠與高純度的伴刀豆球蛋白A共價(jià)結(jié)合）與細(xì)胞膜或核膜上的糖蛋白結(jié)合，從而捕獲細(xì)胞或細(xì)胞核，可實(shí)現(xiàn)少量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作可視化。如ConA磁珠用于用于研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的新型技術(shù)的CUT&Tag和CUT&RUN[5]實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ConA磁珠與細(xì)胞結(jié)合固定，實(shí)現(xiàn)可視化操作，避免離心帶來(lái)的細(xì)胞丟失問(wèn)題。

相對(duì)傳統(tǒng)研究DNA與蛋白互作的ChIP-seq技術(shù)，CUT&Tag和CUT&RUN具備以下優(yōu)勢(shì)：

圖4. ChIP-seq，CUT&Tag，CUT RUN實(shí)驗(yàn)流程示意圖

翌圣自研ConA磁珠，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的原料篩選、多重工藝的優(yōu)化和改善，能夠快速、高效、靈敏、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾分子結(jié)合。主要用于分離細(xì)胞或用于分離細(xì)胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化修飾分子等實(shí)驗(yàn)，特別直接用于CUT  &RUN和CUT&Tag（ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的革新性技術(shù)）等實(shí)驗(yàn)。

相同數(shù)量細(xì)胞與磁珠結(jié)合孵育相同時(shí)間，細(xì)胞分析儀下自動(dòng)檢測(cè)ConA磁珠結(jié)合后剩余細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示翌圣ConA磁珠（Cat#19810）優(yōu)于競(jìng)品。

10µL翌圣ConA磁珠（Cat#19810）和10µL競(jìng)品ConA磁珠，都可結(jié)合E7級(jí)別數(shù)量的細(xì)胞，與競(jìng)品相當(dāng)。重復(fù)操作下，細(xì)胞捕獲率>90%。

按1 mL/管進(jìn)行分裝。儲(chǔ)存條件分別為：4℃，37℃加速處理2天、4天、7天、11天和14天，-20℃破壞處理1天、3天、6天和8天。結(jié)果顯示同等實(shí)驗(yàn)條件下：4℃保存產(chǎn)品、37℃加速處理和-20℃破壞處理的產(chǎn)品細(xì)胞捕獲率＞95%，各處理?xiàng)l件下，3組重復(fù)CV值在1%以內(nèi)，重復(fù)性良好。

參考文獻(xiàn)：

[1].R A Bryce, I H Hillier, J H Naismith, Carbohydrate-protein recognition: molecular dynamics simulations and free energy analysis of oligosaccharide binding to concanavalin A. Biophys J. 81 (Sept. 2001): 1373-88. Abstract. PubMed. Web. 3 Sept. 2010.

[2].Chun-Yang Li, Huai-Long Xu, Bo Liu, Jin-Ku Bao, Concanavalin A, from an Old Protein to Novel Candidate Anti-Neoplastic Drug, Curr Mol Pharmacol. 2010 Nov;3(3):123-8.

[3].Yu-Chen Lee 1, Gregory Block, Huiwen Chen, et al, One-step isolation of plasma membrane proteins using magnetic beads with immobilized concanavalin A, Protein Expr Purif. 2008 Dec;62(2):223-9.

[4].Juanilita T Waniwan, Yi-Ju Chen, Rey Capangpangan, Glycoproteomic Alterations in Drug-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cells Revealed by Lectin Magnetic Nanoprobe-based Mass Spectrometry, J Proteome Res. 2018 Nov 2;17(11):3761-3773.

[5].Hatice S Kaya-Okur, Derek H Janssens, Steven Henikoff, Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag, Nat Protoc. 2020 Oct;15(10):3264-3283.