SP(小鼠/兔IgG)-POD Kit說明書
產(chǎn)品貨號:M20313
產(chǎn)品規(guī)格:3ml/6ml/18ml
產(chǎn)品簡介:
本試劑盒適合于一抗為小鼠/兔IgG的免疫組化實(shí)驗(yàn)DAB顯色。SP試劑盒是專為免疫組化和其他免疫檢測而設(shè)計(jì)的,用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì),同親和素一樣,對生物素有的親和力,親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)(PI=10),經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性,對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低,因此基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。
產(chǎn)品組成:
封閉液(正常山羊血清) | 3ml | 6ml | 18ml |
3% H2O2 | 3ml | 6ml | 18ml |
Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液 | 60ul | 120ul | 360ul |
鏈酶親和素-POD濃縮液 | 30ul | 60ul | 180ul |
稀釋液 | 10ml | 20ml | 60ml |
20×DAB顯色液A | 0.3ml | 0.6ml | 1.8ml |
20×DAB顯色液B | 0.3ml | 0.6ml | 1.8ml |
操作步驟:(以石蠟切片為例)
1. 切片常規(guī)脫蠟至水(三次二甲苯,三次乙醇)。
2. 3% H2O2室溫處理5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
3. 可選步聚:
a. 熱修復(fù)抗原,將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔5-10分鐘后,反復(fù)1-2次。冷卻后PBS(pH7.2-7.6)洗滌1-2次。
b. 酶消化,滴加消化液,37℃10分鐘,PBS(pH7.2-7.4)洗滌2-3次。
c. 跳過此步,直接進(jìn)入下一步。
4. 滴加封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體,免洗。
5. 用稀釋液將一抗按一定比例稀釋(稀釋后的一抗4℃可保存一周),也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗37℃孵育1小時(shí)左右或20℃2小時(shí)左右,也可4℃過夜。PBS(pH7.2-7.4)洗滌3次,每次2分鐘。(一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說,陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí),可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間;背景過高時(shí),可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。)
6. 根據(jù)用量,用稀釋液將Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ulBio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液混勻,此工作液4℃可保存一周)。滴加Bio-羊抗小鼠/兔IgG工作液,20-37℃孵育30分鐘。PBS(pH7.2-7.4)洗滌3次,每次2分鐘。
7. 根據(jù)使用量,用稀釋液將鏈酶親和素-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul鏈酶親和素-POD濃縮液混勻,此工作液4℃可保存一周)。滴加鏈酶親和素-POD工作液,20-37℃,30分鐘。PBS(pH7.2-7.4)洗滌4次,每次5分鐘。
8. DAB顯色:根據(jù)用量,用PBS(pH7.2-7.4)配制,按1ml PBS加入50ul 20×DAB顯色液A,加入50ul 20×DAB顯色液B 。充分混勻后滴加到切片上。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。 蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。 對于細(xì)胞爬片,固定后,PBS漂洗兩次,再用0.5% Triton X-100 室溫孵育20分鐘,PBS漂洗兩次,3% H2O2處理15分鐘;PBS漂洗兩次,接上述第4步。對于冰凍切片,固定后,PBS漂洗兩次,接上述第二步。
注意事項(xiàng):
如果染色背景過高,在SP反應(yīng)之后,DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST(pH7.2-7.4)洗滌切片4次,PBS洗2次,然后DAB顯色。
保存:
如果長時(shí)間不使用,請將所有試劑存放于-20℃,如經(jīng)常使用,可將封閉液,3% H2O2和20×DAB顯色液B存放于2-8℃以方便使用。
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