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            皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)定量檢測試劑盒(ELISA)說明書

            來源:上海仁捷生物科技有限公司   2024年11月01日 10:53  

            僅供科研使用,不得用于臨床診斷

             

            皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)定量檢測試劑盒(ELISA)

             

             

            定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)的濃度。

             

             

            使用試劑盒前,必須仔細(xì)閱讀本說明書。

             

             


            實(shí)驗(yàn)原理

            本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。在預(yù)包被抗皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)抗體(固相抗體)的微孔酶標(biāo)板中,加入皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)校準(zhǔn)品和待測樣本,再加入HRP標(biāo)記的皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)抗原(酶標(biāo)抗原),經(jīng)過溫育與充分洗滌,去除未結(jié)合的組分,在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B,底物在HRP催化下,產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物,在終止液(2M 硫酸)作用下,最終轉(zhuǎn)化為黃色,在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度(OD值),吸光度(OD值)與待測樣品中皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線,可以計(jì)算出樣本中皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT)的濃度。

             

            試劑盒限制性

            1、 僅供科研使用,不得用于臨床診斷。

            2、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用,過期產(chǎn)品不得使用。

            3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

            4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

            5、 如果樣本值高于高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值,請將樣本適當(dāng)稀釋后,再重新測定。

            6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果,檢測前,請排出該因素。

            7、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果,與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

            技術(shù)提示

            1、 混合蛋白溶液時(shí),避免起泡。

            2、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應(yīng)該懸臂加樣,避免交叉污染。

            3、 合適的溫育時(shí)間,和充分的洗滌步驟,是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

            4、 使用自動洗板機(jī)時(shí),加入一個(gè)30秒浸泡的步驟,可以提高檢測精度。

            5、 底物溶液為無色液體,保存過程中變?yōu)樗{(lán)色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。

            6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍(lán)色底物產(chǎn)物,會瞬間變?yōu)辄S色。

            7、 實(shí)驗(yàn)中,用剩的板條,應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

            8、 所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

             

            試劑盒組分與保存

            未開封的試劑盒保存在2-8度,不得使用過期試劑盒。

            組分

            數(shù)量

            主要成分

            開封后儲存

            校準(zhǔn)品

            0.3ml/管

            --

            2-8℃14天

            包被微孔板

            96T/48T

            預(yù)包被固相抗體

            2-8℃14天

            HRP標(biāo)記抗原

            10mL

            HRP標(biāo)記的檢測抗原

            2-8℃180天

            底物液A

            6mL

            0.01%過氧化氫

            2-8℃180天

            底物液B

            6mL

            0.1%TMB

            2-8℃180天

            終止液

            6mL

            2mol/L稀硫酸

            2-8℃180天

            樣本稀釋液

            6mL

            PBS

            2-8℃180天

            20×濃縮洗滌液

            25mL

            0.05%Tween20

            2-8℃180天

            說明書

            1份

            --

            --

            自封袋

            1個(gè)

            --

            --

            不干膠

            2片

            --

            --

            標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:1600、800、400、200、100、0 pg/mL.

            其他用品

            1、 酶標(biāo)儀(450nm)

            2、 精密移液器及一次性吸頭

            3、 蒸餾水

            4、 洗瓶或者自動洗板機(jī)

            5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

            6、 500ml量筒

             

            生物安全

            1、 檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定,嚴(yán)格防止交叉污染,所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

            2、 試劑盒的液體組分中,含有proclin-300防腐劑,可能引起皮膚過敏反應(yīng),避免吸入煙霧與皮膚接觸。

            3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用,避免吸入煙霧。

            4、 戴上防護(hù)手套,實(shí)驗(yàn)完成后洗手。

             

            樣品的采集和儲存

            以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中,不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

            1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清:4000rpm條件下離心20min,去除細(xì)胞顆粒和聚合物,上清液保存在- 20℃以下,避免反復(fù)凍融。

            2、 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,4000rpm條件下離心20min,小心地分離出血清,保存在-20℃以下,避免反復(fù)凍融。

            3、 血漿:肝素,EDTA,或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下,離心20分鐘取上清,血漿保存在-20℃以下,避免反復(fù)凍融。

            樣本收集后,無法一次檢測完畢,請按一次用量分裝凍存,避免反復(fù)凍融,使用時(shí)在室溫下解凍,確保樣品均勻充分解凍。

            4、 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,取上清檢測。

            5、 細(xì)胞提取液:貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞;懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘,取上清檢測。  

            6、 其他生物體液:1000×g 離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。

             

            試劑準(zhǔn)備

            1、 使用前,所有的組分都要至少復(fù)溫60min,確保充分復(fù)溫到室溫。

            2、 濃縮洗滌液:從冰箱取出的濃縮洗滌液,會有結(jié)晶產(chǎn)生,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水,按1:20稀釋,即1份的濃縮洗滌液,添加19份的蒸餾水。

            3、 底物:底物液A和B,在使用前,按1:1體積充分混合,混合后15分鐘內(nèi)使用。

             

             

            操作程序

            所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,建議做復(fù)孔。

            1、 按前面說明書描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。

            2、 從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

            設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,空白孔不加,樣本孔加待測樣本50μL。

            3、除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗原100μL。

            4、 用封板膜蓋住反應(yīng)板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

            5、 揭開封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置20S,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機(jī),請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡30s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應(yīng)板。

            6、 將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

            7、 所有孔加入終止液50μL,在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度(OD值)。

            結(jié)果計(jì)算

            1、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度(OD值)作為縱坐標(biāo),利用計(jì)算機(jī)軟件,采用四參數(shù)Logistic曲線擬合(4-pl),創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,通過樣本的吸光度(OD值),利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

            2、 如果樣品被稀釋,通過上述方法測的濃度值,要乘以稀釋倍數(shù),才是樣品的最終濃度。

             

            試劑盒性能指標(biāo)

            1、物理性能

            試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,無破損漏氣。

            2、劑量反應(yīng)曲線線性

            校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。

            3、精密度

            批內(nèi)精密度:三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

            批間精密度:三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

            4、靈敏度

            檢出劑量小于10 pg/mL。

            5、回收率

            三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評估,回收率在85%-115%之間。

            6、特異性

            本試劑盒識別天然和重組皮質(zhì)酮;腎上腺酮(CORT),與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

            7、穩(wěn)定性

            2℃-8℃保存,有效期6個(gè)月。

            8、 檢測范圍

            50 pg/mL - 1600 pg/mL

             

            免責(zé)聲明

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