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精準診斷，從逆轉(zhuǎn)錄開始——高效逆轉(zhuǎn)錄酶助力RT-qPCR
逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，簡稱RT酶）是一種能夠?qū)NA模板轉(zhuǎn)化為互補DNA（cDNA）的酶。在分子生物學(xué)研究中，逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用極為廣泛，特別是在分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮著作用。通過逆轉(zhuǎn)錄過程，可以將病毒的RNA基因組轉(zhuǎn)換為cDNA，之后便可以利用如qPCR等技術(shù)對其進行擴增和檢測。這一特性使得對諸如艾滋病、甲型流感以及乙型流感這類RNA病毒進行準確診斷成為可能。
圖1. 逆轉(zhuǎn)錄流程示意圖
追求更快速、更靈敏且操作更為簡便的RT-qPCR分子診斷試劑已成為當前的主要發(fā)展趨勢。作為RT-qPCR過程中的關(guān)鍵原料之一，逆轉(zhuǎn)錄酶需要具備更快的逆轉(zhuǎn)錄速度、更高的合成產(chǎn)量以及更好的耐熱性能。為了獲得更適用于RT-qPCR的逆轉(zhuǎn)錄酶，翌圣生物在M-MLV的基礎(chǔ)上通過基因改造，開發(fā)出RNase H活性更低，熱穩(wěn)定性更高，持續(xù)合成能力更強的Hifair® 系列逆轉(zhuǎn)錄酶。
圖2.逆轉(zhuǎn)錄酶作用原理圖
翌圣Hifair®系列逆轉(zhuǎn)錄酶
目前翌圣有多種Hifair®系列逆轉(zhuǎn)錄酶，并且可提供各種劑型的產(chǎn)品，包含單酶、預(yù)混液，您可以根據(jù)實際需求進行選擇。下表羅列了翌圣不同逆轉(zhuǎn)錄酶的特點和推薦應(yīng)用。
表1.翌圣逆轉(zhuǎn)錄酶選擇指南
產(chǎn)品名稱（貨號） | 產(chǎn)品特點 | 推薦應(yīng)用 |
Hifair® III逆轉(zhuǎn)錄酶（11111ES） | 熱穩(wěn)定（高達65℃），適合復(fù)雜模板 | RT-LAMP |
Hifair® V逆轉(zhuǎn)錄酶（11300ES） | 兼容性強，速度快、合成產(chǎn)量高 | 一步法RT-PCR/qPCR |
Hifair® Ultra逆轉(zhuǎn)錄酶（14604ES） | 持續(xù)合成能力強，合成長度可達20 kb | RT-PCR/qPCR、RNA-seq、單細胞測序 |
注：以上所有的酶都有高濃度或無甘油版形式
下面重點介紹一款應(yīng)用在RT-qPCR分子診斷試劑的逆轉(zhuǎn)錄酶：Hifair® V Reverse Transcriptase。該酶兼容性強，速度快、合成產(chǎn)量高，可耐受高達58℃的反應(yīng)溫度，非常適合用于RT-qPCR分子診斷試劑的開發(fā)。
Hifair® V逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示
可耐受58℃反應(yīng)溫度，適合復(fù)雜RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄
圖3.將Hifair® V Reverse Transcriptase及進口品牌T*的逆轉(zhuǎn)錄酶分別在55℃及58℃下孵育30min檢測殘余酶活。結(jié)果顯示Hifair® V Reverse Transcriptase在58℃下孵育30min仍能保持70%活性，遠超進口品牌。
應(yīng)用于RT-qPCR檢出率優(yōu)于其他品牌，檢出范圍：1 pg-1 μg
圖4.以1 pg-1 μg（7個梯度）的293T細胞總RNA為模板，使用Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR(Cat#11142)、V*、T*進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA進行qPCR定量分析。結(jié)果顯示，11142ES靈敏度可達1 pg，檢出率優(yōu)于競品。
翌圣逆轉(zhuǎn)錄酶突變體庫
翌圣生物利用其ZymeEditor™雙向分子酶理性設(shè)計與定向進化平臺，持續(xù)推進逆轉(zhuǎn)錄酶的進化研究。至今，我們已經(jīng)篩選出多種在不同應(yīng)用場景下表現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，能夠全面滿足不同客戶群體在多樣化應(yīng)用領(lǐng)域的需求。
表2.翌圣逆轉(zhuǎn)錄酶突變體選擇指南
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產(chǎn)品類型 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
高性能PCR單酶系列 | Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL | 10726ES |
Hifair®?V Reverse Transcriptase(200 U/μL) | 11300ES | |
Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile,1 U/μL | 10303ES | |
Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) | 10603ES | |
dNTP Mix(25 mM each) | 10125ES | |
超潔凈PCR單酶系列，超低宿主殘留 | Hieff UCF.ME®?Hotstart Sensitive Taq DNA Polymerase (5 U/μL) | 14314ES |
Hifair UCF.ME®?V Reverse Transcriptase (200 U/μL)
| 14608ES | |
UCF.ME®?Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), heat-labile, 1 U/μL | 14466ES | |
UCF.ME®?Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) | 14672ES | |
可凍干PCR單酶系列 | Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA Polymerase, Glycerol-free (5U/μL) | 14316ES |
Hifair®?V Reverse Transcriptase, Glycerol-free(600 U/μL) | 11301ES | |
Uracil DNA Glycosylase(UDG),Heat-Labile(1 U/μL,Glycerol-Free) | 10707ES | |
Murine RNase Inhibitor(200 U/µL,Glycerol-free) | 10703ES |
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