介紹

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）通常是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育進(jìn)程中或者受到某些特定因素影響時(shí)，經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而引發(fā)的一種程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象。在細(xì)胞凋亡的途徑里，各個(gè)事件的發(fā)生具有時(shí)序性，依先后順序逐一出現(xiàn)，最終促成凋亡小體的呈現(xiàn)，接著細(xì)胞便發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育與形態(tài)發(fā)生、維持組織內(nèi)正常細(xì)胞群體的穩(wěn)定、機(jī)體的防御及免疫反應(yīng)、疾病或中毒引發(fā)的細(xì)胞損傷、老化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面都起著至關(guān)重要的作用，并且具備潛在的治療價(jià)值。

圖1：細(xì)胞凋亡途徑各時(shí)序性事件

檢測原理

正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細(xì)胞中磷脂酰絲氨(phosphatidylserine, PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin V是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識別凋亡細(xì)胞表面的PS，而活細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無法與Annexin V特異性結(jié)合。

壞死細(xì)胞的PS也會從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細(xì)胞表面的PS，所以Annexin V無法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡或壞死細(xì)胞。

圖2 Annexin V / PI檢測原理

流式細(xì)胞術(shù)檢測

FITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長525 nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

圖3 流式結(jié)果分析

常見問題

Q：Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測可以應(yīng)用到植物或是細(xì)菌（原核生物）嗎？

A：可以，但是需要制備原生質(zhì)體，因?yàn)橹参锛?xì)胞或是細(xì)菌（原核生物）含有細(xì)胞壁，具體的染液使用劑量只需浸沒細(xì)胞即可，染色時(shí)間對于不同細(xì)胞有一定的不同。

Q：實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何判斷？

A：活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）、裸核（Annexin V-/PI+）。

Q：Annexin V和TUNEL有什么區(qū)別？

A：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 是一種染色方法，用于識別細(xì)胞內(nèi) DNA 片段化位點(diǎn)——晚期細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性特征。

Annexin V 染色通過結(jié)合由于細(xì)胞膜不對稱性喪失而暴露在細(xì)胞外的 PS 殘基來識別細(xì)胞凋亡的早期階段。

Q：是否可以僅使用Annexin V-FITC進(jìn)行檢測而不檢測PI？

A：可以的。對于特殊的檢測樣本，如紅細(xì)胞無細(xì)胞核，或使用藥物Doxorubicin（阿霉素）對PI檢測存在干擾，對于這兩種情況可以僅使用Annexin V-FITC進(jìn)行檢測。

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