裂解液

溫和的非離子型洗滌劑 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保護蛋白的天然結(jié)構(gòu)，同時避免過強的去污劑 (如 SDS) 破壞蛋白相互作用。

MCE 裂解液推薦：WB/IP 裂解液、NP-40 裂解液、哺乳動物活性蛋白抽提試劑。

鹽濃度

樣品準備時體系中的鹽濃度范圍在 150 - 300 mM 即可，過高可能“拆散”蛋白關(guān)系，過低可能導(dǎo)致背景蛋白“攪局”。

蛋白酶抑制劑

適當加入蛋白酶抑制劑，保護“核心成員”防止其被細胞內(nèi)源性蛋白酶降解。

MCE 蛋白酶抑制劑推薦：蛋白酶抑制劑 Cocktail、蛋白酶抑制劑 Cocktail, 片劑。

結(jié)構(gòu)干擾

提前查閱文獻了解蛋白“愛好”，重視蛋白修飾，如磷酸化、乙?；仁欠駮绊憦?fù)合物的穩(wěn)定性。

表達水平

提前驗證目標蛋白表達水平，表達低可考慮優(yōu)化轉(zhuǎn)染或表達條件。

溫度

低溫環(huán)境下制備樣品，防止蛋白“跑路”。

抗體專一性

選擇經(jīng)過 IP 驗證的抗體，不可盲選。

MCE 標簽抗體：DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗體、HA tag 抗體 (YA856)、Myc-tag 抗體。

同型對照

根據(jù) IP 抗體類型選擇合適的同型對照抗體。

MCE 同型對照抗體推薦：Rabbit IgG Isotype Control、Mouse IgG Isotype Control。

抗體來源

一抗和二抗的宿主種屬要避開“同宗”，否則背景會搶戲。

抗體測試

必要時進行預(yù)實驗封閉抗體測試，驗證磁珠/瓊脂糖珠可與抗體有效結(jié)合。

抗體用量

太多可能造成非特異性沉淀，太少又可能拉不住目標蛋白。建議從優(yōu)化實驗中找到合適的濃度和用量。

二抗選擇

如果抗體重鏈和目標蛋白大小相近，可選擇輕鏈特異性二抗避免“撞車”。

實驗設(shè)計

確定研究的蛋白質(zhì)對，不胡亂邀請“不相干”的蛋白。

對照組設(shè)計

實驗組、IgG 陰性組、陽性組 (Input)。

洗滌條件

適當調(diào)整洗滌強度 (如低鹽到高鹽、去垢劑濃度等)，既要去除非特異性蛋白，又要保護靶蛋白復(fù)合物。

Western Blot

用 Western Blot來做最后的“身份確認”，確保邀請到的都是真正的“貴賓”。