摘要：本文詳細闡述了周期型馬來絲蟲多基因克隆構建載體及轉染細胞的研究，通過RT-PCR技術擴增目標基因，構建原核及真核表達載體，并轉染HeLa細胞進行表達分析。研究成功構建了多基因轉化體系，為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎。

引言

馬來絲蟲（Brugia malayi）是一種寄生在人體淋巴系統(tǒng)中的絲蟲，可引起馬來絲蟲病。根據(jù)其微絲蚴出現(xiàn)于外周血液的時間，馬來絲蟲可分為夜現(xiàn)周期型和亞周期型。周期型馬來絲蟲成蟲寄生于人體四肢淺部淋巴系統(tǒng)，特別是下肢，導致急性淋巴結炎、淋巴管炎及象皮腫等癥狀。馬來絲蟲病的防治主要依賴于藥物治療，然而，藥物的副作用及抗藥性的出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)變得尤為重要。

熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的免疫原，在多種寄生蟲中均有表達，并顯示出良好的免疫保護效果。此外，馬來絲蟲M29編碼基因也被認為是一種潛在的疫苗候選分子。因此，克隆和表達這些基因，構建其轉化體系，對于開發(fā)抗絲蟲感染疫苗及藥物具有重要意義。

本研究旨在克隆周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因，構建原核及真核表達載體，并轉染HeLa細胞進行表達分析，從而為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供基礎。通過多基因克隆及載體構建，我們期望能夠篩選出高效表達的基因，進一步推進絲蟲病防治策略的發(fā)展。

材料與方法

1. 實驗材料

• 蟲體材料：周期型馬來絲蟲成蟲，由南通大學醫(yī)學院寄生蟲學教研室提供。

• 細胞系：HeLa細胞，購自ATCC細胞庫。

• 載體：原核表達載體pGEX-4T-3，真核表達載體pcDNA3.1（+），由實驗室保存。

• 試劑：某試劑RNA提取試劑盒、某試劑反轉錄試劑盒、某試劑PCR擴增試劑盒、某試劑DNA凝膠回收試劑盒、某試劑T4 DNA連接酶、某試劑質(zhì)粒提取試劑盒、某試劑限制性內(nèi)切酶、某試劑IPTG誘導劑、某試劑細胞培養(yǎng)基、某試劑轉染試劑。

• 儀器：某品牌臺式高速離心機、某品牌紫外可見分光光度計、某品牌高壓滅菌器、某品牌凝膠成像系統(tǒng)、某品牌PCR儀、某品牌水平電泳槽、某品牌電泳儀、某品牌恒溫培養(yǎng)箱、某品牌電熱恒溫鼓風干燥箱、某品牌恒溫水浴箱、某品牌旋渦振蕩器、某品牌超凈工作臺、威尼德電穿孔儀。

2. 實驗方法

2.1 總RNA提取及反轉錄

• 從周期型馬來絲蟲成蟲中提取總RNA，使用某試劑RNA提取試劑盒按照說明書操作。

• 將提取的總RNA反轉錄為cDNA，使用某試劑反轉錄試劑盒，按照說明書操作。

2.2 基因克隆及載體構建

• 根據(jù)GenBank上公布的周期型馬來絲蟲HSP70基因（登錄號：M68933）及M29編碼基因的序列，設計引物。

• 使用某試劑PCR擴增試劑盒，以cDNA為模板擴增目的基因。

• PCR產(chǎn)物經(jīng)某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測后，使用某試劑DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

• 將目的片段與原核表達載體pGEX-4T-3及真核表達載體pcDNA3.1（+）分別進行雙酶切，使用某試劑限制性內(nèi)切酶，按照說明書操作。

• 使用某試劑T4 DNA連接酶將目的片段與載體連接，構建重組質(zhì)粒。

• 將重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌DH5α中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

• 挑取單克隆菌落，使用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定及測序驗證。

2.3 重組蛋白表達及鑒定

• 將構建成功的重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

• 挑取單克隆菌落，接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。

• 加入IPTG誘導劑，37℃恒溫搖床繼續(xù)培養(yǎng)4小時。

• 收集菌體，使用SDS-PAGE進行蛋白表達分析，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達情況。

2.4 細胞轉染及表達分析

• 將HeLa細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞密度達到70%-80%。

• 使用某試劑轉染試劑，按照說明書操作，將構建成功的真核表達載體轉染至HeLa細胞中。

• 轉染后48小時，收集細胞，使用SDS-PAGE進行蛋白表達分析，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達情況。

實驗結果

1. 基因克隆及載體構建

成功克隆了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因，并構建了原核表達載體pGEX-4T-3-HSP70、pGEX-4T-3-M29及真核表達載體pcDNA3.1（+）-HSP70、pcDNA3.1（+）-M29。雙酶切鑒定及測序驗證結果表明，構建的重組質(zhì)粒符合預期大小，且序列正確。

2. 重組蛋白表達及鑒定

在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達了重組蛋白GST-HSP70及GST-M29，SDS-PAGE分析結果顯示，誘導組出現(xiàn)特異性蛋白表達條帶，與預計大小相符。目的蛋白占菌體總蛋白的10%-15%。

3. 細胞轉染及表達分析

成功將真核表達載體pcDNA3.1（+）-HSP70及pcDNA3.1（+）-M29轉染至HeLa細胞中，SDS-PAGE分析結果顯示，轉染組出現(xiàn)特異性蛋白表達條帶，與預計大小相符。目的蛋白在HeLa細胞中成功表達。

討論

本研究成功構建了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因的原核及真核表達載體，并實現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細胞中的高效表達。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎。

1. 基因克隆及載體構建策略

在基因克隆及載體構建過程中，我們選擇了常用的EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，以確保目的片段與載體的正確連接。同時，通過測序驗證確保了構建的重組質(zhì)粒序列正確，為后續(xù)實驗提供了可靠的基礎。

2. 重組蛋白表達及鑒定

在大腸桿菌中表達重組蛋白時，我們選擇了IPTG誘導劑進行誘導表達，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白的表達情況。結果表明，構建的重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定表達目的蛋白，且表達量較高。這一結果為后續(xù)純化及功能研究提供了基礎。

3. 細胞轉染及表達分析

在細胞轉染實驗中，我們選擇了常用的某試劑轉染試劑進行轉染，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白在HeLa細胞中的表達情況。結果表明，構建的真核表達載體能夠成功轉染至HeLa細胞中，并表達目的蛋白。這一結果為后續(xù)免疫學研究及疫苗研發(fā)提供了基礎。

4. 研究的創(chuàng)新與應用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于成功構建了周期型馬來絲蟲多基因克隆轉化體系，并實現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細胞中的高效表達。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了新的思路和方法。未來，我們將進一步開展免疫學研究，評估目的蛋白的免疫保護效果，為絲蟲病防治策略的發(fā)展提供科學依據(jù)。