一、 測(cè)定原理

ORAC 法(oxygen radical absorbance capacity，氧自由基吸收能力)是由 Cao 等在 Glazer  研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的抗氧化能力的測(cè)定方法。它具有生物相關(guān)性強(qiáng)，可以通過(guò)改變自由 基和反應(yīng)體系的溶劑測(cè)定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性，方法的專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(趙建 等，2011)，因而近年在研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

該方法以偶氮類化合物作為自由基來(lái)源，熒光素鈉作為指示劑，水溶性維生素 E（Trolox） 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行抗氧化分析。氧自由基通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）過(guò)程使熒光探針氧化，并隨 著時(shí)間的推移淬滅熒光探針(Huang et al., 2015)。分析中存在的抗氧化劑可阻止熒光探針氧化， 推遲熒光的猝滅，直至樣品中的抗氧化劑活性耗盡。因此可以通過(guò)熒光衰減的曲線來(lái)計(jì)算抗 氧化物質(zhì)的氧自由基清除能力：樣品的氧自由基清除能力越強(qiáng)，熒光素鈉的淬滅越慢，則熒 光強(qiáng)度曲線下面積(AUC)越大。

二、 試劑及耗材組成

稀釋液：100 mL×1 瓶

試劑一：熒光素鈉 100μL ×1 支

試劑二：自由基引發(fā)劑 粉劑 ×1 支

陽(yáng)性對(duì)照：1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液 1mL×1 支（乙醇配制）

黑色熒光酶標(biāo)板 ×1 片

試劑一配制瓶 ×1 個(gè)

加樣槽 ×1 個(gè)

三、 儲(chǔ)存條件及有效期

-20℃可保存 6 個(gè)月。

四、 試劑的配制

試劑一應(yīng)用液：將試劑一小心轉(zhuǎn)入 10mL 稀釋液中，采用試劑一配制瓶配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑二應(yīng)用液：在試劑二瓶?jī)?nèi)加入 15mL 稀釋液，冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液：首先將 1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液使用稀釋液¹按照 1：25 稀釋成 40μM 溶液(最終體系為 200μL，樣品/trolox 添加量為 50μL，因此 40μM trolox 的體系終濃度為 10μM)。

稀釋方法：取 1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液 400μL，加入 9.6mL 稀釋液，充分搖勻，得到終濃 度為 10μM Trolox 溶液 10mL（實(shí)際濃度為 40μM）。

按照下表稀釋得到不同濃度的 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液²：

¹ 稀釋液一般應(yīng)該與樣品稀釋液保持一致，水溶性樣品可直接采用本試劑盒提供的稀釋液， 脂溶性樣品需自備稀釋液；

² 標(biāo)準(zhǔn)曲線不是必需步驟，但是推薦制作。表中給出的濃度為建議值，您也可以根據(jù)自己樣 品的抗氧化能力適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

五、 操作步驟

直接在黑色熒光酶標(biāo)板按照下表加樣：

充分混勻，37℃避光靜置

充分混勻²，立即采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀設(shè)定參數(shù)如下：

振蕩時(shí)間：5s（可選） 

孵育溫度：37℃； 

激發(fā)波長(zhǎng)：485±20nm； 

發(fā)射波長(zhǎng)：520±20nm； 

讀取方式³：1-5min 讀取 1 次，連續(xù)讀取 60 - 90 min 

¹迅速加入，建議使用多道移液器快速加入； 

² 如酶標(biāo)儀具備振蕩功能，建議使用酶標(biāo)儀振蕩以節(jié)約時(shí)間； 

³ 至少反應(yīng) 60min，2min 讀取一次數(shù)據(jù)；也可將讀取時(shí)間延長(zhǎng)至 90min。

六、計(jì)算方法

1.計(jì)算曲線下面積(AUC) 

將讀取得到的初始熒光值(即開始檢測(cè)后第一次讀取的熒光值)記為 F0，第 n 次檢測(cè)讀取 得到的熒光值記為 Fn，則采用微積分的思路，AUC 可由如下公式計(jì)算： 

AUC = F0/F0 + F1/F0 + F2/F0 + …… + Fn/F0 

2. 計(jì)算凈曲線下面積（netAUC） 

如下圖所示，首先如上述計(jì)算不加任何抗氧化劑的孔（空白）的 AUC，得到空白 AUC （AUCblank），將樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）AUCsample 值減去 AUCblank，即為凈曲線下面積（netAUC）。 

netAUC = AUCsample –AUCblank 

3. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 

將各濃度 Trolox 計(jì)算得到的 netAUC 線性擬合成為標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

例如：計(jì)算得到 netAUC 和標(biāo)準(zhǔn)曲線如下： 

4. 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品等價(jià)的 Trolox 當(dāng)量 

如計(jì)算得到樣品溶液 netAUC 值為 6.66，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，該樣品溶液與 0.57 μM  TE 的 netAUC 相等，則該樣本溶液 ORAC 值為 0.57 μM TE (Trolox equivalent) . 如已知樣本溶液的濃度為 100 μg/mL，則可進(jìn)一步計(jì)算該樣品的 Trolox 當(dāng)量為 5.7 μmol TE/g。

七、注意事項(xiàng)

1. 本試驗(yàn)需要使用到具有熒光功能的酶標(biāo)儀，建議使用同時(shí)具備熒光測(cè)定、孵育、振搖和 酶促動(dòng)力學(xué)讀取功能的酶標(biāo)儀。請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)前確定實(shí)驗(yàn)室具備此測(cè)定條件，且在試驗(yàn)前先行了 解測(cè)試程序的設(shè)置；

2. 請(qǐng)事先準(zhǔn)備好多道移液器（排槍）；

3. 建議先將樣品梯度稀釋后進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，不在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)會(huì)造成較大誤差；

4. 試劑二應(yīng)用液建議在加入試劑一應(yīng)用液后的等待時(shí)間內(nèi)配制，以盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí)， 試劑二請(qǐng)務(wù)必迅速加入，盡可能保證各孔加樣時(shí)間一致，以減小系統(tǒng)誤差(Mellado-Ortega et al., 2017)。

5. netAUC 可不計(jì)算，只是標(biāo)準(zhǔn)曲線不過(guò)原點(diǎn)，但不影響結(jié)果準(zhǔn)確性。本說(shuō)明書中給出的計(jì) 算方法是較為簡(jiǎn)單的一種，也可參考相應(yīng)論文中較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠?jì)算公式。

6. ORAC 測(cè)試的樣品既可為脂溶性，也可為水溶性。脂溶性樣品處理更為復(fù)雜，因此更推薦采用親水溶劑制備樣品。