Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis

Keywords: atherosclerosis; carotid arteries; endothelium; hemodynamics; inflammation; transforming growth factor beta.

動脈粥樣硬化是一種累及大中型動脈的慢性、進行性、炎癥性疾病，最終可導(dǎo)致急性心血管事件，如心肌梗死和中風(fēng)。層流和擾動流會激活內(nèi)皮細胞中不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別導(dǎo)致抗動脈粥樣硬化表型和致動脈粥樣硬化表型。最近，體外和體內(nèi)研究表明，暴露于擾動流的內(nèi)皮細胞經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT），這通過細胞間粘附的溶解、細胞極性的改變和間充質(zhì)標(biāo)志基因的表達來促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。與擾動流相反，單向?qū)恿饕种?EndMT。TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）是驅(qū)動 EndMT 的核心介質(zhì)，內(nèi)皮 TGF-β 已被證明與動脈粥樣硬化的進展有關(guān)。然而，人們對內(nèi)皮 TGF-β 信號在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中如何激活以及層流和紊亂血流如何調(diào)節(jié)內(nèi)皮 TGF-β 信號傳導(dǎo)知之甚少。

肌腱蛋白X（TN-X，tenascin-X）是 tenascin 家族的細胞外基質(zhì)糖蛋白，可形成同源三聚體，并具有多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。缺乏該蛋白會導(dǎo)致經(jīng)典型艾勒斯-當(dāng)洛綜合征，即彈性蛋白或膠原蛋白結(jié)構(gòu)異常，引起皮膚、關(guān)節(jié)和血管的脆弱性增加。

基于此，德國普朗克心肺研究所、法蘭克福歌德大學(xué)分子醫(yī)學(xué)中心及中國西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心的研究團隊于 Circulation Research 期刊在線發(fā)表了題為“Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis”的研究成果，表明內(nèi)皮細胞響應(yīng)單向?qū)恿鞅磉_ TN-X，并通過結(jié)合 TGF-β 抑制內(nèi)皮細胞中 TGF-β誘導(dǎo)的信號，從而介導(dǎo)對 EndMT 和動脈粥樣硬化的保護。

首先，為了鑒定被層流上調(diào)的基因，將人臍靜脈內(nèi)皮細胞保持在靜態(tài)條件或暴露于單向?qū)恿鳎?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">12 dynes/cm2，48 h），發(fā)現(xiàn) >500個基因發(fā)生變化，除了流量依賴性表達基因（如 KLF2 和 KLF4）外，還發(fā)現(xiàn)其他幾個基因被強烈上調(diào)，包括編碼細胞外基質(zhì)糖蛋白 TN-X 的 TNXB (圖1 A）。與靜態(tài)條件下的低表達相比，暴露于層流 24 小時導(dǎo)致其 RNA 和蛋白質(zhì)水平強烈上調(diào)（圖1 B、C）。雖然單向?qū)恿髟黾恿?TNXB 表達以及包括 KLF2 和 KLF4 在內(nèi)的其他血流依賴性基因的表達（圖1 B），但誘導(dǎo)炎癥基因（包括 CCL2 和 VCAM1）表達的振蕩流（4 dynes/cm2，1 Hz）不會誘導(dǎo) TNXB 或 KLF2 和 KLF4 的表達（圖1 D、E）。

然后，測試了幾種機械感應(yīng)和機械信號蛋白，如 PIEZO1、ERK5、KLF2 和 KLF4 的敲低是否影響層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達，發(fā)現(xiàn)雖然敲低 PIEZO1、ERK5 和 KLF2 對層流誘導(dǎo)的 TNXB 上調(diào)沒有影響，但抑制 KLF4 表達降低了層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達。進一步分析表明，KLF4 與至少 2 個結(jié)合位點的結(jié)合在流動反應(yīng)中增加，其中一個結(jié)合位點發(fā)生突變時，導(dǎo)致層流誘導(dǎo)的TNXB啟動子激活喪失，表明其在介導(dǎo)KLF4-依賴性TNXB 表達調(diào)控中的關(guān)鍵作用。以上這些數(shù)據(jù)表明，層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達是由 KLF4 介導(dǎo)的。

為了測試層流是否也在體內(nèi)誘導(dǎo) TNXB 表達，分析了在 Tnxb 啟動子控制下表達 β-半乳糖苷酶的小鼠細胞系。在主要暴露于單向?qū)恿鞯闹鲃用}弓外曲率內(nèi)皮中，β-半乳糖苷酶活性明顯高于血流受干擾的主動脈弓內(nèi)曲率內(nèi)皮（圖1 F）。對內(nèi)皮細胞特異性 TN-X 缺失小鼠進行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中 TN-X 的染色不受 TN-X 內(nèi)皮丟失的影響。在人主動脈切片中，還發(fā)現(xiàn) TNXB 在層流區(qū)域（如降主動脈）的內(nèi)皮層中高表達，而在主動脈弓內(nèi)曲率的內(nèi)皮表達相對較低（圖1 G、H）。此外，人主動脈內(nèi)皮細胞 TNXB 的表達與 VCAM1 的表達呈負相關(guān)（圖1 G、I）。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)體外和體內(nèi)暴露于單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力時，內(nèi)皮細胞的 TNXB 表達強烈增加。

圖1    層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮 TN-X（tenascin-X）的表達。

為了研究體內(nèi)條件下的內(nèi)皮 TN-X 功能，研究了 EC-Tnxb-KO 小鼠。兩周后，觀察到 Vcam1 表達和內(nèi)皮下 CD68 陽性細胞的數(shù)量都強烈增加。這些改變不僅在主動脈弓的內(nèi)曲率中觀察到，而且在外曲率中也觀察到。繼續(xù)進行部分頸動脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化，發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)皮細胞特異性 TN-X 丟失導(dǎo)致頸動脈新內(nèi)膜形成強烈增加。16 周后，小鼠的主動脈、主動脈根部以及頭臂動脈中動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和進展強烈增加。在暴露于單向?qū)恿鞯膮^(qū)域（如降主動脈）和暴露于擾動流的區(qū)域（如主動脈弓的內(nèi)曲率）中，都觀察到動脈粥樣硬化進展增加。

接下來，為了了解缺失 TN-X 的情況下內(nèi)皮炎癥增加的機制，分析了暴露于不同流動模式的內(nèi)皮細胞的各種標(biāo)志物。RT-qPCR 顯示 EndMT 標(biāo)志物的表達增加，如 fn1、Notch3、Vim、Mmp2、Mmp9、Fsp1、Acta2、Zeb1 和 Twist1。這伴隨著 EC-Tnxb-KO 小鼠內(nèi)主動脈內(nèi)皮中 Smad2 的磷酸化增加，這表明在沒有 TN-X 的情況下 TGF-β 信號增加。同樣，在人降主動脈和主動脈弓內(nèi)曲率中也發(fā)現(xiàn) TN-X 表達與纖連蛋白的表達和 Smad2 的磷酸化呈負相關(guān)。

為了測試缺失 TN-X 的情況下 EndMT 和炎癥標(biāo)志物表達的增加以及 Smad2 磷酸化的增加是否確實是由于 TGF-β 活性的增加，用抗-TGF-β 抗體處理 EC-Tnxb-KO 小鼠。在內(nèi)皮 TN-X 缺失的情況下，抑制 TGF-β 阻斷了 Smad2 磷酸化增加以及 EndMT 炎癥標(biāo)志物表達的增加（圖2 A、C），還強烈減少了小鼠部分頸動脈結(jié)扎后新內(nèi)膜的形成（圖2 D、E）。此外，LDL（低密度脂蛋白）受體缺陷型小鼠TN-X 缺失的內(nèi)皮細胞中動脈粥樣硬化進展的增加（圖2 F、G）。

為了測試內(nèi)皮 TGF-β 信號是否導(dǎo)致 EndMT 標(biāo)志物表達增加，生成TN-X 以及 TGF-β 受體1、2丟失的小鼠，發(fā)現(xiàn)在 EC-Tnxb-KO 小鼠中Smad2 磷酸化水平和纖連蛋白表達的增加降低到對照水平。此外，缺乏 LDL 受體的小鼠中觀察到的新內(nèi)膜形成增加，當(dāng)內(nèi)皮細胞中缺乏 TGF-β 受體 1 和 2 時也減少。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮細胞 TN-X 丟失后，EndMT 和炎癥是由內(nèi)皮細胞中 TGF-β 信號增加引起的。

圖2    抑制 TGF-β  阻斷 EC-Tnxb-KO 小鼠EndMT 和血管炎癥的發(fā)展。

由于 TN-X 在內(nèi)皮細胞中的缺失會引起典型的 TGF-β介導(dǎo)的藥物變化，這可以通過 TGF-β 的藥理學(xué)抑制來阻斷，實驗假設(shè) TN-X 抑制 TGF-β 活性或其下游信號。因此，研究人員確定了 TN-X 濃度增加對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中 TGF-β 誘導(dǎo)的 Smad2/Smad3 磷酸化的影響，并發(fā)現(xiàn) TN-X 抑制 TGF-β 的作用（圖3 A）。此外，層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達伴隨著 TGF-β誘導(dǎo)的 Smad 磷酸化強烈降低。然而，當(dāng)層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達被小干擾 RNA 介導(dǎo)的敲低阻斷時，這種效果未被觀察到（圖3 B）。這表明內(nèi)源性上調(diào)的 TN-X 也能夠在體外抑制 TGF-β。

最后，為了進一步表征 TN-X 對 TGF-β誘導(dǎo)的細胞效應(yīng)的影響，研究了 TGF-β 與固定 TGF-β 受體在TN-X 的 C 端部分（由 5 個 FN （纖連蛋白）III 型樣結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域組成）缺失或存在的情況下的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)TN-X 以濃度依賴性方式抑制 TGF-β 與其受體的結(jié)合（圖3 C）。

為了測試 TN-X 是通過與受體結(jié)合還是與 TGF-β 結(jié)合來阻斷 TGF-β 與其受體之間的相互作用，進行免疫共沉淀實驗分析 TN-X 與 TGF-β 及其受體的相互作用。成熟的 TGF-β 與抗-TN-X 抗體特異性共沉淀，反之亦然（圖3 D），而沒有觀察到 TN-X 與 TGF-β 受體的細胞外部分共沉淀（圖3 D），而細胞外部分很容易與 TGF-β 共沉淀。亞結(jié)構(gòu)域分析顯示，FBG 結(jié)構(gòu)域（而不是 FN III 型樣結(jié)構(gòu)域）與 TGF-β 相互作用（圖3 E）。這些數(shù)據(jù)強烈表明，TN-X 通過其 FBG 結(jié)構(gòu)域直接與 TGF-β 相互作用，從而阻止其與 TGF-β 受體相互作用。

圖3    TN-X 結(jié)合 TGF-β 并作為 TGF-β清除劑發(fā)揮作用。

TN-X 在保護內(nèi)皮細胞免受 TGF-β誘導(dǎo)的 EndMT 中的流動依賴性功能的示意圖。單向?qū)恿髡T導(dǎo)內(nèi)皮 TNXB 的表達。同源三聚體 TN-X 通過其 C 端 FBG 結(jié)構(gòu)域與 TGF-β 結(jié)合，從而阻止 TGF-β 與其在內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合。

總之，這項研究數(shù)據(jù)將 TN-X 確定為生理剪切應(yīng)力發(fā)揮抗炎和動脈粥樣硬化保護活性的核心效應(yīng)子，其作用機制是抑制 TGF-β 活性和 EndMT。模擬 TN-X 介導(dǎo)的 TGF-β 和 EndMT 抑制可能是干擾慢性炎癥性血管疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化）進展的新機制。

參考文獻：Liang G, Wang S, Shao J, Jin YJ, Xu L, Yan Y, Günther S, Wang L, Offermanns S. Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis. Circ Res. 2022 May 27;130(11):1647-1659. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320694. Epub 2022 Apr 21. PMID: 35443807.

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