一、菌種代碼的意義

國(guó)內(nèi)常見(jiàn)微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是：

CMCC（F）或 CMCC（B）

CMCC —— 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

B —— 代表細(xì)菌

F ——代表真菌

大腸桿菌：CMCC (B) 44102；

乙型副傷寒沙門桿菌：CMCC (B) 50094；

銅綠假單胞菌：CMCC (B)10104；

金黃色葡萄球菌：CMCC (B)26003；

生孢梭菌：CMCC(B)64941；

白色念珠菌：CMCC(F)98001。

二、菌種的復(fù)蘇

按照菌種的使用說(shuō)明將復(fù)蘇液在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇。

三、常用菌種保藏方法

1、瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個(gè)月傳代一次。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年。

（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用；缺點(diǎn)是保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。

（4）注意事項(xiàng)：

a.保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。

b.保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。

c.每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。

d.保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。

e.銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法

（1）方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。

將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1cm為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。

（2）適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。

（3）特點(diǎn)：本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。

（4）注意事項(xiàng)：

a.保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。

b.使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。

c.將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染.

d.液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜。

e.制備無(wú)菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。

3、磁珠保存法

將菌液浸入素?zé)胖?/span>(或多孔玻璃珠)后再進(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無(wú)水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10~20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。

本法對(duì)酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。

磁珠保存時(shí)間更長(zhǎng)，使用方便，大大減輕操作人員的工作。

四、常用菌種保藏方法

方法一：斜面?zhèn)鞔?/span>

冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入超凈工作臺(tái)或生物安全柜。

點(diǎn)燃酒精燈（滅菌器），用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住試管塞，撥開(kāi)試管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。

堵上試管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開(kāi)試管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。

取出接種棒，在火焰旁將試管塞堵上，然后將接種棒在火焰上燒灼滅菌。

將已接種完的斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24小時(shí)，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。

 方法二：斜面-營(yíng)養(yǎng)肉湯-分離平板-斜面

用接種環(huán)取上述斜面菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5ml/支，已滅菌)，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液，接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，用接種針選典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板：

大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；

銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基；

金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。

五、菌種保管

菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，雙人雙鎖，確保菌種安全。

菌種領(lǐng)用、傳代、保存都要有記錄，包括名稱、入庫(kù)、領(lǐng)用、傳代日期、鑒定者、主要鑒定性能及滅活或銷毀情況。

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