LNPs作為一種有前景的核酸藥物和疫苗遞送系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的治療中。mRNA疫苗能夠通過LNPs將編碼特定抗原的mRNA遞送至抗原呈遞細(xì)胞（APCs），如DCs，進(jìn)而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗癌免疫反應(yīng)。然而，盡管LNPs在mRNA疫苗遞送中表現(xiàn)出色，但其在circRNA疫苗遞送中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索。LNP的組成，包括可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇及其他成分，對(duì)疫苗的遞送效率和免疫效果具有重要影響。因此，本研究旨在系統(tǒng)評(píng)估不同LNP組成對(duì)circRNA疫苗遞送及T細(xì)胞應(yīng)答的影響。
材料與方法
本研究使用了六種可電離脂質(zhì)（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）、三種輔助脂質(zhì)（DSPC、DOPE、9A1P9）以及不同摩爾比的膽固醇和β-谷甾醇。此外，還使用了編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA（mRNA-fLuc）作為蛋白質(zhì)表達(dá)研究的模型，以及兩種已驗(yàn)證治療潛力的小circRNA疫苗（circRNA-SIINFEKL和circRNA-E7）用于T細(xì)胞應(yīng)答研究。
結(jié)果與討論
2.1 LNP組成對(duì)體外轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響：
在體外實(shí)驗(yàn)中，我們系統(tǒng)地評(píng)估了不同LNP組成對(duì)DC2.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。首先，使用編碼螢火蟲熒光素酶（fLuc）的mRNA（mRNA-fLuc）作為模型，制備了包含六種不同可電離脂質(zhì)（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）的LNPs。結(jié)果表明，SM-102 LNP在DC2.4細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果較好，顯著高于其他可電離脂質(zhì)。在蛋白質(zhì)表達(dá)方面，SM-102 LNP同樣表現(xiàn)出最佳性能，在所有測(cè)試濃度下（0.5、1、2 μg/mL mRNA）均誘導(dǎo)出較高的熒光素酶表達(dá)。進(jìn)一步地，我們?cè)u(píng)估了三種輔助脂質(zhì)（DSPC、DOPE、9A1P9）對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果顯示，基于SM-102的可電離脂質(zhì)，DOPE LNP在DC2.4細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果較優(yōu)，盡管DSPC和9A1P9 LNP之間的轉(zhuǎn)染效率差異不顯著。最后，我們研究了不同膽固醇和β-谷甾醇摩爾比對(duì)LNP轉(zhuǎn)染效率和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有19%膽固醇和19.5% β-谷甾醇摩爾比的LNP（F3）在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最高的mRNA和circRNA轉(zhuǎn)染效率。然而，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面，雖然F3 LNP表現(xiàn)出較高的水平，但與其他配方相比差異并不顯著。Fig. 1. Physicochemical properties and the in vitro characterization of the six mRNA-fLuc-LNPs. Fig. 2. In vivo LN delivery of mRNA-fLuc by six different ionizable LNPs.2.2 LNP組成對(duì)體內(nèi)遞送及T細(xì)胞應(yīng)答的影響：
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們通過皮下注射的方式將mRNA-fLuc LNPs注入BALB/c小鼠的足墊，并評(píng)估其在引流淋巴結(jié)（PO LNs）中的遞送效率和蛋白質(zhì)表達(dá)。IVIS生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，SM-102和ALC-0315 LNP在注射后6小時(shí)和24小時(shí)均表現(xiàn)出最高的熒光素酶表達(dá)。這表明這兩種LNP配方在體內(nèi)遞送mRNA方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。為了評(píng)估circRNA疫苗的免疫原性，我們將編碼SIINFEKL抗原的小circRNA（circRNA-SIINFEKL）加載到LNPs中，并皮下注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)。免疫后21天，通過流式細(xì)胞術(shù)分析外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中的抗原特異性CD8+ T細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，SM-102和ALC-0315 LNP誘導(dǎo)的SIINFEKL特異性CD8+ T細(xì)胞比例顯著高于其他配方。此外，我們還評(píng)估了不同膽固醇和β-谷甾醇摩爾比對(duì)circRNA疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的影響。使用編碼HPV-16 E7抗原的小circRNA（circRNA-E7）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，F(xiàn)1（100%膽固醇）LNP誘導(dǎo)的E7特異性CD8+ T細(xì)胞比例最高，盡管F3（19%膽固醇和19.5% β-谷甾醇）LNP在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率和蛋白質(zhì)表。Fig. 3. Mouse CD8+ T study response elicited by circRNA-SIINFEKL loaded in LNPs with different ionizable lipids, respectively. Fig. 4. In vitro and in vivo protein expression by mRNA-fLuc and in vivo T cell response by circRNA-E7 delivered by LNPs with different sterol lipid ratios.2.3 LNP組成對(duì)免疫細(xì)胞亞群的影響：
為了進(jìn)一步探究不同LNP配方對(duì)免疫細(xì)胞亞群的影響，我們使用編碼OVA抗原的circRNA（circRNA-OVA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并評(píng)估了其在引流淋巴結(jié)中不同免疫細(xì)胞亞群中的轉(zhuǎn)染效率和抗原表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)1和F3 LNP在CD45+淋巴細(xì)胞和DCs中轉(zhuǎn)染效果較好，且F1 LNP能夠顯著上調(diào)MHC II表達(dá)，表明其增強(qiáng)DC成熟和抗原呈遞的能力。這些發(fā)現(xiàn)與之前的蛋白質(zhì)表達(dá)和T細(xì)胞應(yīng)答結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了F1 LNP在誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答方面的優(yōu)勢(shì)。Fig. 5. Intracellular delivery and immune activation of immune cell subsets in mouse draining LNs upon s.c. injection of circRNA-OVA LNPs in mice.結(jié)論
本研究系統(tǒng)評(píng)估了不同LNP組成對(duì)circRNA疫苗遞送及T細(xì)胞應(yīng)答的影響。結(jié)果表明，SM-102是可電離脂質(zhì)中的標(biāo)線標(biāo)線較優(yōu)，而膽固醇和β-谷甾醇的摩爾比對(duì)LNP的遞送效率和免疫效果具有重要影響。富含膽固醇的LNP（如F1）更適合于需要強(qiáng)免疫激活的應(yīng)用，而摻入β-谷甾醇的LNP（如F3）則可能在減少促炎反應(yīng)方面具有優(yōu)勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)LNP作為circRNA治療劑和疫苗的載體提供了重要思路。
未來研究方向
未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索LNP各成分之間的相互作用及其對(duì)LNP穩(wěn)定性和遞送效率的影響。此外，還應(yīng)評(píng)估不同LNP配方在預(yù)防和治療疾病中的實(shí)際效果，以優(yōu)化circRNA疫苗的臨床應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)：Alshehry, Yasir, et al. "Investigation of the impact of lipid nanoparticle compositions on the delivery and T cell response of circRNA vaccine." Journal of Controlled Release (2025): 113617.
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