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            【實(shí)驗(yàn)安全處置篇】免疫組化中的染色劑

            來源:武漢博歐特生物科技有限公司   2025年04月09日 10:26  

            【實(shí)驗(yàn)安全處置篇】免疫組化中的染色劑

             biorbyt 英國biorbyt


            免疫組化在臨床及病理診斷中已廣泛應(yīng)用,對疾病的判定、鑒別診斷及判定疾病的預(yù)后及臨床醫(yī)師對疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。其在蛋白抗原的細(xì)胞準(zhǔn)確定位上是其他蛋白檢測方法無法相比的。
            免疫組化的基本操作異常結(jié)果分析我們在之前的文章中已經(jīng)和大家分享過了,今天我們主要來說一說免疫組化中經(jīng)常用到的“底物和染色劑”!
            對于辣根過氧化物酶來說,我們常規(guī)用DAB(二氨基聯(lián)苯胺)或AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色。
            DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑
            DAB(二氨基聯(lián)苯胺)通常作為過氧化物酶最敏感、*常用的顯色底物。細(xì)胞顆粒中的過氧化物酶,能將過氧化氫中的氧釋放出來,氧化二氨基聯(lián)苯胺,形成棕黃色沉淀而定位于過氧化物酶活性的部位。反應(yīng)產(chǎn)物不溶于水、二甲苯和醇,因而適用于多數(shù)復(fù)染劑和封片劑。
            在DAB顯色后,還可以使用溶于乙醇的染料進(jìn)行后續(xù)染色。可配合DAB染色使用的復(fù)染方法包括亞甲基藍(lán)、甲基綠和蘇木精。
            另外因?yàn)槠潆娮用芏雀?,可用于電子顯微鏡觀察。還可以通過用硫酸鎳或氯化鉆進(jìn)行后處理,可以產(chǎn)生更好的對比度。


            左:人乳腺纖維瘤組織的免疫組織化學(xué)染色anti-CD206 (Biorbyt,dilution at 1:100)   

            右:小鼠皮膚組織的IHC-P染色anti-CD45 (Biorbyt,dilution at 1:100)



            但是DAB屬于聯(lián)苯胺類化合物(BZC)中的一種,現(xiàn)已被證實(shí)具有免疫毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性等毒性,尤其對泌尿系統(tǒng)可致膀胱癌,被國際癌癥研究中心(IARC)確認(rèn)為致癌物。如果用DAB,液體配制應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,操作者應(yīng)戴口罩和手套。一般認(rèn)為工作液危害較小;但粉劑危害較大。除使用過程中要特別注意安全防護(hù)外,使用后的廢液存放和去毒性處理也應(yīng)引起高度重視


            在我國由于實(shí)驗(yàn)室比較分散,單個(gè)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢液量較少,很少受到實(shí)驗(yàn)使用人員和有關(guān)部門的重視,大多實(shí)驗(yàn)室都是未經(jīng)任何處理直接排入下水道,這種情況下日積月累、積少成多也是非??膳碌?。為保護(hù)環(huán)境,減少污染,每個(gè)使用DAB的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)把DAB廢液的去毒性處理制定成一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室守則,嚴(yán)格執(zhí)行。


            DAB的毒性處理原則是DAB分子-全被破壞且反應(yīng)副產(chǎn)物和終產(chǎn)物也必須不具備誘變性。一直被沿用至今的是“硫酸-高錳酸鉀法”,DAB被處理后不但分子被*全破壞,反應(yīng)終產(chǎn)物也無誘變性,處理后可以按普通實(shí)驗(yàn)室廢液處置。具體處理步驟如下


            1 硫酸-高錳酸鉀水溶液的配制

            a.0.2 M高錳酸鉀水溶液:高錳酸鉀31.6 g,蒸餾水1000 ml;


            b.2.0M的硫酸水溶液:濃硫酸112 ml,蒸餾水1000 ml。


            2 收集廢棄DAB液     包括顯色后洗片、洗器皿的自來水和剩余的DAB顯色液,稀釋后DAB的濃度不超過0.9 mg/ml。



            3 去毒性反應(yīng)    廢棄DAB液每10 ml加入上述5 mla液和5 mlb液,混合后靜置不低于10 h或過夜,此時(shí)DAB的致癌性基本解除。



            4 脫色     加入抗壞血酸或草酸脫色,邊加邊攪拌至廢液退至無色。



            5 中和    加入碳酸氫鈉中和pH值6至8,經(jīng)PH試紙檢測。



            6 處理    有廢液回收條件的按普通實(shí)驗(yàn)室廢液回收,沒有回收條件的可以混合大量自來水傾入下水道沖走。

            與硫酸-高錳酸鉀法相比,被*認(rèn)更有效的處理方式是焚燒廢棄物的處置方法,DAB廢棄物加入燃料被焚燒后苯環(huán)*全被破壞,排出的有毒的氮氧化物可以通過洗滌器除去。但焚燒法需要有專業(yè)的回收和存放,較適合集中DAB的毒性處理,而硫酸-高錳酸鉀法較適合實(shí)驗(yàn)室使用。



            AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色劑
            AEC(3-氨基-9-乙基咔唑),雖然溶于乙醇,因?yàn)楸菵AB致癌危險(xiǎn)性低,目前也已經(jīng)應(yīng)用廣泛。
            AEC產(chǎn)生鮮紅色,與用蘇木精復(fù)染可形成鮮明的對比。但注意應(yīng)用不含乙醇的蘇木精,如Mayer,而不用Harris,以避免將溶于乙醇的AEC有色反應(yīng)產(chǎn)物溶解。
            當(dāng)抗原- 抗體- 酶濃度高時(shí),AEC 可能產(chǎn)生棕黃色產(chǎn)物(AEC有兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn),當(dāng)其中一個(gè)被轉(zhuǎn)變時(shí),變成紅色;當(dāng)兩個(gè)都和過氧化物酶反應(yīng)時(shí),產(chǎn)生棕綠色產(chǎn)物)。pH值為4.8的乙酸緩沖液能減輕這一反應(yīng)。切片應(yīng)用水性介質(zhì)(如80%甘油)封片。水性封片劑含有少量有機(jī)溶劑,可使染色慢慢溶解或消失。注意不能用乙醇脫水。甘油封片可用指甲油將蓋玻片邊緣密封以長期保存。
            其他染色劑還有a-萘酚派若寧(粉色)、4-氯1-茶酚(藍(lán)色)和Hanker-Yates 以及大量廣譜染色劑 (見下表1)。反應(yīng)底物也適用于堿性磷酸酶。有些底物在酶位點(diǎn)上持續(xù)反應(yīng),產(chǎn)生顆粒狀有色物質(zhì),從而使堿性磷酸酶系統(tǒng)反應(yīng)更敏感。但如果反應(yīng)過度,這些顆??赡苁菇M織形態(tài)模糊。





            參考資料:

            [1]陳慶,康維鈞,聯(lián)苯胺類化合物的毒性研究進(jìn)展.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(6):460.

            [2]王晉芬,王躍華.DAB廢物處理程序中華病理學(xué)雜志,2005,34(12):775.

            [3]David J.Dabbs.診斷免疫組織化學(xué)[M],第二版,周庚寅,翟啟輝,張慶慧,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2008.7:19-20。


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