β-羥基丁酸測(cè)定試劑盒,簡(jiǎn)單、靈敏的BHB含量測(cè)定方法
β-羥基丁酸(BHB)是一種在長(zhǎng)時(shí)間禁食、低碳水化合物攝入或劇烈運(yùn)動(dòng)期間產(chǎn)生的酮體。作為能量代謝和燃料利用中的關(guān)鍵參與者,BHB在葡萄糖供應(yīng)受限,為大腦、心臟和骨骼肌等多種組織提供替代能量來(lái)源。BHB還作為一種信號(hào)分子,影響基因表達(dá)、氧化應(yīng)激、炎癥和其他細(xì)胞過(guò)程。其代謝意義不僅限于能量供應(yīng),還涉及多種生理和病理過(guò)程。AkrivisBio的BHB檢測(cè)試劑盒是一種簡(jiǎn)單、靈敏的BHB含量測(cè)定方法。在檢測(cè)中,BHB被氧化生成NADH,隨后NADH用于將四氮雜卓還原為具有450納米吸收峰的高色素甲臜。該檢測(cè)的靈敏度適用于測(cè)量低至10微摩爾的BHB樣本。
艾美捷β-羥基丁酸測(cè)定試劑盒:
貨號(hào):MA-0132
規(guī)格:100孔
樣本類型:血清、血漿、細(xì)胞裂解液、組織提取液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)基
適用物種:通用(適用于所有物種)
檢測(cè)方法:比色法,檢測(cè)波長(zhǎng)405納米
檢測(cè)類型:定量
應(yīng)用:基于微孔板的比色法檢測(cè),用于定量檢測(cè)廣泛樣本中的胰蛋白酶活性。
靈敏度:0.05-0.1mU
儲(chǔ)存條件:4°C
運(yùn)輸條件:凝膠冷藏包
β-羥基丁酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)組分:
-檢測(cè)緩沖液:25毫升,貨號(hào)WMMA-0132-A
-β-羥基丁酸脫氫酶:凍干粉,綠色,貨號(hào)MA-0132-B
-NAD/四氮雜卓混合液:凍干粉,紅色,貨號(hào)MA-0132-C
-β-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品:凍干粉,黃色,貨號(hào)MA-0132-D
β-羥基丁酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)原理:
1.β-羥基丁酸脫氫酶將BHB氧化為乙酰乙酸,生成NADH。
2.NADH將電子轉(zhuǎn)移至四氮雜卓,將其轉(zhuǎn)化為甲臜。
儲(chǔ)存和處理:
在使用前將試劑盒儲(chǔ)存于-20°C。使用前將檢測(cè)組分恢復(fù)至室溫。打開(kāi)試劑瓶前請(qǐng)短暫離心。
-檢測(cè)緩沖液:直接使用,儲(chǔ)存于4°C。
-β-羥基丁酸脫氫酶:用220微升檢測(cè)緩沖液溶解。使用時(shí)保持在冰上,儲(chǔ)存于-20°C。
-NAD/四氮雜卓混合液:用220微升檢測(cè)緩沖液溶解,儲(chǔ)存于-20°C。
-β-HB標(biāo)準(zhǔn)品:用100微升去離子水溶解,配制成10mM的溶液,儲(chǔ)存于-20°C。
檢測(cè)步驟:
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至90微升去離子水中,配制成0.4mM的工作溶液。將0、5、10、15、20、25微升的工作溶液分別轉(zhuǎn)移至96孔板的多個(gè)孔中,用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,得到每孔0、2、4、6、8、10納摩爾的BHB標(biāo)準(zhǔn)系列。
2.樣本準(zhǔn)備:體液中的β-HB含量差異較大(血清中為20微摩爾-5毫摩爾),尿液中可能更高。血液和尿液中的還原物質(zhì)可能會(huì)干擾檢測(cè)。使用10kDa離心過(guò)濾器可以減少這種干擾。向測(cè)試孔中加入1-50微升樣本,用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。
-注意事項(xiàng):
-還原物質(zhì)和其他所謂的基質(zhì)效應(yīng)可以輕松處理。請(qǐng)參閱下一頁(yè),了解處理顯著干擾檢測(cè)的方法。
-在極少數(shù)情況下,樣本中存在還原型吡啶核苷酸NAD(P)H,可能會(huì)干擾檢測(cè)。在這種情況下,運(yùn)行一個(gè)背景對(duì)照,用2微升檢測(cè)緩沖液代替β-HB脫氫酶。從配對(duì)樣本中減去這個(gè)背景值,以獲得校正后的β-HB讀數(shù)。
-所有樣本讀數(shù)必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。如果讀數(shù)超出此范圍,請(qǐng)稀釋樣本并重新運(yùn)行。
3.啟動(dòng)反應(yīng):每個(gè)反應(yīng)需要50微升反應(yīng)混合液。根據(jù)要運(yùn)行的總孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液:
-反應(yīng)混合液:
-檢測(cè)緩沖液:46微升
-β-HB脫氫酶:2微升
-NAD/四氮雜卓混合液:2微升
-背景對(duì)照混合液:
-檢測(cè)緩沖液:48微升
-NAD/四氮雜卓混合液:2微升
-向含有β-HB標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的每個(gè)孔中加入50微升反應(yīng)混合液。
4.測(cè)量:在450納米處監(jiān)測(cè)反應(yīng)30分鐘。標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)迅速顯色,但樣本的顯色可能會(huì)更慢。
5.計(jì)算:
-從所有標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)中減去0BHB標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)。繪制背景校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
-確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,這將用于定義未知樣本中的BHB含量。通過(guò)從配對(duì)樣本中減去任何背景對(duì)照來(lái)校正未知樣本。將校正后的樣本讀數(shù)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,以獲得樣本孔中的BHB納摩爾數(shù)。
-將這些值轉(zhuǎn)換回原始樣本中的BHB含量:
-A.孔中的BHB納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=樣本中的BHB納摩爾數(shù)/微升
-B.樣本中的BHB納摩爾數(shù)/微升×樣本體積=樣本中的總BHB納摩爾數(shù)
-C.如果樣本因信號(hào)過(guò)高而稀釋,請(qǐng)乘以稀釋因子。
-注意:許多代謝物和其他化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)顯著干擾各種反應(yīng)化學(xué)。為了更精確的測(cè)定,請(qǐng)?jiān)谟袩o(wú)恒定量樣本的情況下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。不必運(yùn)行所有六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品;至少使用3個(gè)(0-10-20微升)來(lái)驗(yàn)證吸光度響應(yīng)與分析物量呈線性關(guān)系。兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)相同。它們之間的吸光度偏差歸因于樣本中的分析物量(在本例中為β-羥基丁酸)。如果兩個(gè)斜率不同,則存在基質(zhì)效應(yīng)影響反應(yīng)化學(xué)。在這種情況下,確定0標(biāo)準(zhǔn)品之間的吸光度差異,并將其應(yīng)用于在樣本存在下運(yùn)行的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
具有大矩陣效應(yīng)的樣品示例:
-0標(biāo)準(zhǔn)品之間的差異為0.35。在樣本存在下的斜率為0.226OD/納摩爾。
-樣本中具有基質(zhì)效應(yīng)的分析物量=0.35OD/0.226OD/納摩爾=1.55納摩爾
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