甘油三酯是由3個脂肪酸和甘油組成的三酯，是動物和植物體內(nèi)脂肪的主要成分。甘油三酯中存在的脂肪酸類型幾乎涵蓋了所有已知的天然脂肪酸。多種脂肪酶可以釋放這些脂肪酸，隨后被用于能量產(chǎn)生或其他目的。AkrivisBio的甘油三酯檢測試劑盒提供了一種簡單、靈敏的甘油三酯測量方法，適用于多種生物樣本。甘油三酯含量可以通過比色法（最大吸收波長570納米）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長535/587納米）進行測定。比色法的檢測范圍為每孔0-10納摩爾，熒光法的靈敏度下限為1-5皮摩爾。

艾美捷甘油三酯測定試劑盒：

貨號：MA-0110

規(guī)格：100孔

樣本類型：組織提取液、細胞裂解液、血清、血漿、尿液

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測方法：比色法，檢測波長570納米；或熒光法，激發(fā)/發(fā)射波長=535/587納米

檢測類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法/熒光法檢測，用于測量樣本中的甘油三酯水平。比色法檢測范圍為0-10納摩爾/孔，熒光法檢測范圍為1-5皮摩爾/孔。

靈敏度：<1微摩爾

儲存條件：-20°C

運輸條件：凝膠冷藏包

甘油三酯測定試劑盒檢測組分：

-檢測緩沖液：25毫升，貨號WMMA-0110-A

-ADHP溶液：200微升，紅色，貨號MA-0110-B

-脂肪酶：凍干粉，藍色，貨號MA-0110-C

-甘油氧化混合液：凍干粉，綠色，貨號MA-0110-D

-甘油三酯標準品：0.3毫升，黃色，貨號MA-0110-E

甘油三酯測定檢測原理：

1.單酯、二酯和三酯甘油被脂肪酶水解，生成游離脂肪酸和游離甘油。

2.甘油被氧化，生成化學(xué)計量的過氧化氫。

3.過氧化氫和我們的ADHP探針作為過氧化物酶的底物，產(chǎn)生強烈的顏色和熒光。

用戶自備材料：

-0.1-0.5%無過氧化物的洗滌劑溶液

儲存和處理：

將試劑盒儲存于-20°C。使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫。打開試劑瓶前請短暫離心，以使可能粘附在蓋子上的組分脫落。

-ADHP溶液：DMSO在略低于室溫時會凍結(jié)。使用前必須恢復(fù)至室溫。儲存于-20°C。

-脂肪酶：用220微升檢測緩沖液溶解。分裝后儲存于-20°C。

-甘油氧化混合液：用220微升檢測緩沖液溶解。最好分裝后儲存于-20°C，以避免反復(fù)凍融。

-甘油三酯標準品：在冷凍時可能會沉淀。為了重新溶解，將試劑瓶放入熱水（80-100°C）中加熱，直至溶液變得渾濁（2-3分鐘）。在加熱時渦旋混合，這將使其冷卻并再次變?yōu)槌吻迦芤骸Ｖ貜?fù)加熱/冷卻一次。標準品現(xiàn)在可以使用。

檢測步驟：

1.標準曲線：

-比色法檢測：將40微升甘油三酯標準品加入160微升檢測緩沖液中。將0、10、20、30、40、50微升分別加入96孔板的多個孔中，用檢測緩沖液將孔體積調(diào)整至50微升。各孔分別含有0、2、4、6、8、10納摩爾的甘油三酯。

-熒光法檢測：將10微升甘油三酯標準品加入490微升檢測緩沖液中。將0、10、20、30、40、50微升分別加入多個孔中，分別得到0、200、400、600、800、1000皮摩爾的甘油三酯。由于熒光法的靈敏度較高，可以通過進一步稀釋標準品，使用0-200皮摩爾范圍的標準曲線。

2.樣本準備：

-使用100微升無過氧化物的洗滌劑溶液裂解10?細胞。將10毫克組織在100微升洗滌劑溶液中勻漿。勻漿液/細胞裂解液應(yīng)像標準品一樣經(jīng)歷加熱/冷卻循環(huán)。體液（血清、腦脊液、唾液等）可以直接使用。將每種樣本加入至96孔板的孔中，每種樣本加入50微升，成對加入，其中一對作為背景對照。如果最終樣本讀數(shù)不在標準曲線范圍內(nèi)，應(yīng)適當(dāng)稀釋并重新運行。

-有時基質(zhì)效應(yīng)會導(dǎo)致背景值較高和標準曲線斜率變淺，這是由于試劑盒中酶的活性發(fā)生改變。在這種情況下，最好向成對測試樣本中的一個加入2-4納摩爾的甘油三酯標準品作為內(nèi)標。兩個樣本之間的吸光度差異可用于確定未知甘油三酯含量與加入標準品的比例。

3.樣本水解：

-向每個標準品和樣本孔中加入2微升脂肪酶。背景對照孔不加脂肪酶。讓水解反應(yīng)進行20-30分鐘。

4.甘油氧化：

-根據(jù)要測量的孔數(shù)準備足夠的甘油氧化混合液，每個孔需要50微升。

-反應(yīng)混合液：

-比色法：檢測緩沖液46微升，ADHP溶液2微升，甘油氧化混合液2微升。

-熒光法：檢測緩沖液47.8微升，ADHP溶液0.2微升，甘油氧化混合液2微升。

-向含有甘油三酯標準品、樣本和背景對照的每個孔中加入50微升反應(yīng)混合液。充分混合。在室溫下孵育30-60分鐘（60分鐘效果稍好），避光?；蛘?，可以在反應(yīng)進行時用微孔板讀數(shù)器監(jiān)測反應(yīng)進程。能夠觀察反應(yīng)動力學(xué)通?？梢蕴峁┧璧囊娊?。

5.測量：

-通過比色法（570納米吸光度）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長535/587納米）監(jiān)測反應(yīng)進程。當(dāng)標準品的信號不再變化時，反應(yīng)完成。達到終點的時間應(yīng)少于60分鐘。

6.典型結(jié)果：

7.計算：

-從所有標準品讀數(shù)中減去0標準品的讀數(shù)。繪制校正后的標準曲線。確定標準曲線的斜率。斜率決定了OD/納摩爾或熒光/皮摩爾。對于吸光度大于約1OD的值，吸光度曲線有明顯的凸性。熒光法檢測中也觀察到類似的凸性。將數(shù)據(jù)擬合到二階多項式比直線擬合能更準確地計算未知樣本的含量。

-從測試樣本的總吸光度中減去配對背景對照的吸光度，以確定未知樣本中的甘油三酯含量，然后根據(jù)原始細胞數(shù)量或組織質(zhì)量校正樣本稀釋度。

-A.測試樣本的原始吸光度-背景對照的吸光度=測試樣本的凈吸光度

-B.凈吸光度/標準曲線的斜率=樣本孔中的甘油三酯納摩爾數(shù)

-C.樣本孔中的甘油三酯納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/微升

-D.樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/微升×加入樣本的洗滌劑溶液總體積=樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)

-E.樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克組織（或細胞數(shù)量等）=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克（或細胞數(shù)量等）

-使用內(nèi)標計算：

-A.（樣本+加入標準品）的吸光度-（僅樣本）的吸光度=內(nèi)標的吸光度

-B.內(nèi)標的吸光度/加入的標準品納摩爾數(shù)=OD/甘油三酯納摩爾數(shù)

-C.（僅樣本）的吸光度/OD/甘油三酯納摩爾數(shù)=測試樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)

-D.樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克組織（或細胞數(shù)量等）=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克（或細胞數(shù)量等）